鉄欠乏耐性植物の育成

种植耐缺铁植物

• 批准号: 05278213
• 负责人: 西澤 直子
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05278213/
• 关键词: 形質転換植物; 砂漠緑化; 鉄欠乏ストレス; 食糧生産; ムギネ酸; フィトシデロフォア; 環境; バイオテクノロジー

既に明らかにしている、ムギネ酸類生合成経路のうち、S-アデノシルメチオニンからニコチアナミン(1)ニコチアナミンから未知のケト中間体(2)、さらにデオキシムギネ酸(3)までの経路を司る酵素の単離精製を試みた。鉄欠乏条件下で水耕栽培し、鉄欠乏クロロシスの現れたオオムギの新根のみを集め粗酵素液を調製した。(1)の酵素活性検定法としては、^<14>C-Sアデノシルメチオニンから^<14>C-ニコチアナミンの生成をHPLC,TLCにより検出する方法によった。同じく(2)の酵素はニコチアナミンを投与し、未知のケト中間体の生成を、ケト基に特異的な還元試薬NaBH_4を用いてデオキシムギネ酸に変換し、HPLCにより検出した。(3)の酵素についてはコファクターとしてα-ケトグルタル酸のみを与えた後中間体を生成後、各分画画分を添加してデオキシムギネ酸の生成をHPLCにより検出する。以上の検定法を用い、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラム、二次元電気永動法により、(1)と(2)の酵素の部分精製に成功した。これらの部分アミノ酸配列を気相プロテインシークエンサーにより決定したところ、(1)の酵素についてはN末端がブロックされていたので、これを断片化し配列を決定している。(2)の酵素については4種類のペプチドのアミノ酸配列が得られた。これに相同のDNA合成プローブを作製し、鉄欠乏オオムギ根のcDNAライブラリーを用いて遺伝子のクローニングを行っている。さらに、合成プライマーを用いてPCRの手法により、この遺伝子をクローニングすることを試みている。

分离负责先前确定的麦根酸生物合成途径的酶，从 S-腺苷甲硫氨酸到烟酰胺 (1)，从烟酰胺到未知的酮中间体 (2)，并进一步到脱氧麦根酸 (3)，我尝试对其进行精炼。通过仅收集在缺铁条件下水培生长并表现出缺铁失绿的大麦的新根来制备粗酶溶液。 (1)的酶活性测定方法是通过HPLC和TLC检测14 C-S腺苷甲硫氨酸生产14 C-烟酰胺。类似地，对于酶(2)，施用烟酰胺，并且使用酮基特异性还原剂NaBH_4将未知酮中间体的形成转化为脱氧麦根酸，并通过HPLC检测。对于酶(3)，仅提供α-酮戊二酸作为辅因子并产生中间体，然后添加各级分并通过HPLC检测脱氧麦根酸的产生。利用上述测定方法，我们通过疏水色谱、羟基磷灰石柱和二维电泳成功地部分纯化了酶(1)和(2)。当使用气相蛋白质测序仪测定这些部分氨基酸序列时，酶(1)的N末端被封闭，因此将其片段化并测定了序列。对于酶(2)，获得了四种肽的氨基酸序列。我们已经创建了与该基因同源的 DNA 合成探针，并使用来自缺铁大麦根的 cDNA 文库克隆该基因。此外，我们正尝试使用合成引物通过 PCR 克隆该基因。

项目成果

K.Kanazawa et al: "Biosynthetic pathway of phytosiderophores in iron-deficient gramineous plants" Plant & Soil. 155. 107-109 (1993)

K.Kanazawa 等：“缺铁禾本科植物中植物铁载体的生物合成途径” 植物

K.Kanazawa et al: "Inductions of two enzyme acevities involved in the biosynthesis of mugineic acid in Fe deficient barley root" Plant & Soil. (in press). (1994)

K.Kanazawa 等人：“在缺铁大麦根中诱导参与麦根酸生物合成的两种酶活性”植物

K.Higuchi et al: "Purification and Characterization of nicotianamine synthase from Fe deficient barley roots" Plant & Soil. (in press). (1994)

K.Higuchi 等人：“来自缺铁大麦根的烟酰胺合酶的纯化和表征”植物

K.Suzuki et al: "Partial amino-acid sequences of a peptide induced by Fe deficiency in barley roots" Plant & Soil. (in press). (1994)

K.Suzuki 等人：“大麦根缺铁诱导的肽的部分氨基酸序列” 植物