疾患特異的iPS細胞を用いた拡張型心筋症の病態解明と新規治療法の開発

阐明扩张型心肌病的病理学并利用疾病特异性 iPS 细胞开发新疗法

基本信息

批准号：
22KJ0429
负责人：
下田柚須乃
金额：
$ 1.6万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0429/
关键词：
拡張型心筋症 iPS細胞心筋細胞 LMNA遺伝子

项目摘要

当該年度では、LMNA遺伝子変異を有する拡張型心筋症（Dilated cardiomyopathy: DCM）患者由来iPS細胞の樹立およびその特性解析、心筋細胞分化誘導を行った。３名のDCM患者の末梢血から単核球を抽出し、エピソーマルプラスミドベクターを用いたリプログラミングを行い、疾患特異的iPS細胞を樹立した。作製したiPS細胞株に対して、蛍光免疫染色・フローサイトメトリーにより未分化マーカータンパク質の発現を認め、各細胞株の未分化状態を確認した。また、三胚葉分化確認のため胚葉体形成を行い、蛍光免疫染色で外・内・中胚葉の各種マーカータンパク質の発現を評価し、多分化能を確認した。さらに、ゲノムDNAを抽出してシークエンス解析を行ったところ、樹立したiPS細胞は、それぞれの患者で確認されている変異と同等のものを有していた。続いて、iPS細胞由来心筋細胞（iPSC-CM）への分化誘導を行った。iPSC-CMは、誘導10日前後で自律的な拍動を示し、心筋サルコメアタンパク質の発現を認めた。さらに、LMNA遺伝子がコードする核膜タンパク質LaminA/Cの発現量をウエスタンブロッティングで解析したところ、患者由来の細胞で発現量が減少していた。以上の結果の一部について、論文発表した（Shimoda et al., Stem Cell Research 2022)。現在は、各患者の有する変異と、LaminA/Cのタンパク質発現量・その機能の関係については現在解析途中である。さらに、細胞株による心筋細胞分化効率の不均一性が認められており、今後予定しているRNA-seq等の遺伝子発現解析に向けて、より安定した心室系心筋細胞の誘導法確立を進めている。

在本财年，我们建立了源自LMNA基因突变的扩张型心肌病（DCM）患者的iPS细胞，分析其特性并诱导心肌细胞分化。从三名 DCM 患者的外周血中提取单核细胞，并使用附加型质粒载体进行重编程，以建立疾病特异性 iPS 细胞。通过荧光免疫染色和流式细胞术观察所创建的iPS细胞系中未分化标记蛋白的表达，并确认各细胞系的未分化状态。此外，进行胚状体形成以确认三个胚层分化，并使用荧光免疫染色评估外胚层、内胚层和中胚层的各种标记蛋白的表达以确认多能性。此外，当提取基因组 DNA 并进行序列分析时，建立的 iPS 细胞含有与每位患者中发现的突变相同的突变。接下来，诱导分化为 iPS 细胞来源的心肌细胞 (iPSC-CM)。 iPSC-CM在诱导后10天左右表现出自主跳动，并观察到心肌肌节蛋白的表达。此外，当通过蛋白质印迹分析LMNA基因编码的核膜蛋白LaminA/C的表达水平时，发现患者来源的细胞中表达水平降低。我们发表了一篇关于上述部分结果的论文（Shimoda 等人，干细胞研究 2022）。我们目前正在分析每位患者的突变与LaminA/C蛋白表达水平和功能之间的关系。此外，根据细胞系的不同，心肌细胞分化效率也存在异质性，我们正在努力建立一种更稳定的心室心肌细胞诱导方法，以用于未来的RNA-seq等基因表达分析。

项目成果

期刊论文数量（1）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Generation of a human induced pluripotent stem cell line derived from a patient with dilated cardiomyopathy carrying LMNA nonsense mutation

源自携带 LMNA 无义突变的扩张型心肌病患者的人诱导多能干细胞系的产生

DOI：
10.1016/j.scr.2022.102793
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
1.2
作者：
Shimoda Yuzuno;Murakoshi Nobuyuki;Mori Haruka;Xu DongZhu;Tajiri Kazuko;Hemmi Yasuko;Sato Iori;Noguchi Michiya;Nakamura Yukio;Hayashi Yohei;Ieda Masaki
通讯作者：
Ieda Masaki