心筋細胞と心筋線維芽細胞の相互作用に着目した拘束型心筋症・心室拡張障害の病態解明

阐明限制性心肌病和心室舒张障碍的发病机制，重点关注心肌细胞和心肌成纤维细胞之间的相互作用

• 批准号: 22K08101
• 负责人: 小垣 滋豊
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08101/
• 关键词: 拘束型心筋症; 心筋線維芽細胞; iPS細胞

当院にて心臓移植を受けた小児拘束型心筋症患者の血液細胞から、山中4因子を発現するセンダイウイルスベクターを用いることで、iPS細胞株を樹立した。このiPS細胞株は、患者と同様、トロポニンＩ遺伝子にミスセンス変異を有しており、この変異はこれまでの既報やClinvarにおいても、pathogenicとされているバリアントである。また、正常核型を維持していること、3胚葉への分化能を維持していることを確認した。次に、このiPS細胞株を心筋細胞へと分化誘導したところ、95%以上の高率で心筋細胞へと分化誘導可能であった。さらに、このiPS細胞株に対して、CRISPR/Cas9システムを用いることで、トロポニンＩの変異を修復したiPS細胞株（Isogenic corrected line)と、ホモ接合体にした株（Homo line)を作成した。すべてのiPS細胞株は同様に心筋細胞への良好な分化誘導が可能であった。これらの細胞株を用いて、心筋細胞へと分化誘導したのちに、健常の心筋線維芽細胞と共培養を行った。これはインサートを用いたindirect co-cultrue系で行った。48時間の共培養の後、心筋線維芽細胞のRNA-seqを行ったところ、ヘテロ接合体である患者iPS細胞由来心筋細胞と共培養した心筋線維芽細胞は、その発現パターンが、isogenic corrected iPS細胞由来心筋細胞と共培養した心筋線維芽細胞や、共培養を行っていない線維芽細胞と比較して、かなり異なっており、またこの差異はHomo -iPS由来の心筋細胞と共培養した心筋線維芽細胞ではより顕著であった。

使用表达山中四因子的仙台病毒载体，从在我院接受心脏移植的儿童限制性心肌病患者的血细胞中建立了 iPS 细胞系。这个iPS细胞系和患者一样，在肌钙蛋白I基因中存在错义突变，而这种突变是在之前的报告和Clinvar中被认为致病的变异体。我们还证实它们保持了正常的核型和分化成三个胚层的能力。接下来，当诱导该iPS细胞系分化为心肌细胞时，可以以超过95％的高比率诱导分化为心肌细胞。此外，通过对该iPS细胞系使用CRISPR/Cas9系统，我们创建了肌钙蛋白I突变被校正的iPS细胞系（同基因校正系）和纯合系（Homo系）。所有 iPS 细胞系同样能够诱导良好分化为心肌细胞。这些细胞系被诱导分化为心肌细胞，然后与健康的心肌成纤维细胞共培养。这是通过使用插入物的间接共培养系统完成的。共培养48小时后，对心肌成纤维细胞进行RNA-seq，发现与杂合子患者iPS细胞来源的心肌细胞共培养的心肌成纤维细胞的表达模式与同基因校正的iPS细胞相似。与细胞来源的心肌细胞共培养的成纤维细胞和未共培养的成纤维细胞存在显着差异，并且这种差异也是由于与Homo-iPS来源的心肌细胞共培养的心肌成纤维细胞在母细胞中更为明显。