三量体GTP結合蛋白質とムスカリン性K^+チャネルの相互作用の解析

三聚体 GTP 结合蛋白与毒蕈碱 K^+ 通道之间的相互作用分析

基本信息

批准号：
07770058
负责人：
稲野辺厚
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770058/
关键词：
カリウムチャネル G蛋白質

项目摘要

三量体G蛋白質(G蛋白質)βγサブユニットにより活性が制御される内向き整流カリウムチャネル(K_Gチャネル)は、中枢神経系、心房等に存在することが電気生理学的に知られていた。ところが、K_Gチャネルの活性化がβγサブユニットによる直接的な相互作用によるものか、結論付けられてはいなかったので、K_Gチャネルの構成分子として1994年にcloningされたGIRK1とG蛋白質との相互作用が解析可能ではないかと考えられた。そこで、細胞質側に露出していると推測されるGIRK1のN末端及び、C末端の両領域を大腸菌で発現し、G蛋白質との結合実験を行った。その結果、βγサブユニットとGIRK1のC末端は直接結合し、その様式はG蛋白質活性化機序と合致することが明らかとなった。K_Gチャネルを生化学的に検討するために、GIRK1のC末端領域に対する抗体を作製した。この抗GIRK1抗体は、大脳、小脳、心房、そし精巣の細胞膜画分中において、電気泳動上55-70kDaの蛋白質を認識した。これらの分子量の差異は、各組織における糖鎖修飾の差異によるものと考えられる。そこで抗GIRK1抗体を用いて、大脳に発現するGIRK1を含むK_Gチャネルの解析を行った。その結果、免疫沈降法による解析から、数種の蛋白質の複合体として存在すること、ショ糖密度勾配法とゲルろ過法による解析から、その複合体はtetramerとして存在することが明らかになった。さらに、免疫組織染色法により、GIRK1は第三脳室周辺において、presynapseに局在することが明らかとなった。中枢神経系において、K_Gチャネルはpostsynaptic inhibitionに関与すると考えられている。つまりこの結果は、synapse制御機構において、GIRK1を含むK_Gチャネルはpresynaptic inhibitionに関与し、postsynaptic inhibitionには他のチャネル蛋白質からなるK_Gチャネルが機能していることを示すものと考えられる。

电生理学上已知，内向整流钾通道（K_G通道）存在于中枢神经系统、心房等，其活性由三聚体G蛋白（G蛋白）的βγ亚基控制。然而，K_G通道的激活是否是由于与βγ亚基的直接相互作用尚未得出结论，因此认为1994年作为K_G通道的组成分子克隆的GIRK1与G蛋白之间的相互作用。可以分析。因此，我们在大肠杆菌中表达了假定暴露在细胞质侧的GIRK1的N端和C端区域，并进行了与G蛋白的结合实验。结果表明，βγ亚基与GIRK1的C端直接结合，且其方式与G蛋白激活机制一致。为了对 K_G 通道进行生化研究，我们生成了针对 GIRK1 C 末端区域的抗体。这种抗 GIRK1 抗体可通过电泳识别大脑、小脑、心房和睾丸细胞膜部分中的 55-70kDa 蛋白质。这些分子量差异被认为是由于每个组织中糖链修饰的差异造成的。因此，我们使用抗GIRK1抗体来分析大脑中表达的含有GIRK1的K_G通道。结果，通过免疫沉淀分析表明其以多种蛋白质的复合物形式存在，通过蔗糖密度梯度和凝胶过滤分析表明该复合物以四聚体形式存在。此外，免疫组织化学染色显示 GIRK1 位于第三脑室周围的突触前。在中枢神经系统中，K_G 通道被认为参与突触后抑制。换句话说，这个结果似乎表明，在突触控制机制中，包括GIRK1在内的K_G通道参与突触前抑制，而由其他通道蛋白组成的K_G通道则发挥突触后抑制作用。