G蛋白質によるカリウムチャネル制御機構の構造生物学的および電気生理学的研究

G蛋白钾通道控制机制的结构生物学和电生理学研究

基本信息

批准号：
07J01798
负责人：
横川真梨子
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J01798/
关键词：
イオンチャネル NMR 3量体G蛋白質相互作用解析 G蛋白質

项目摘要

NMR法を用いて、GβγによるGIRK開閉機構の立体構造の観点からの解明をさらに進めた。具体的には、GIRK-Gβγ間相互作用のNMR解析に必要なGIRK細胞内領域の主鎖アミドプロトンの帰属を進めることにより93%の帰属を完了し、データベースに登録した(BMRB accession number:11067)。帰属に基づき、転移交差飽和実験と化学シフト摂動(CSP)実験結果より、GIRK上のGβγ結合部位および結合に伴う構造変化領域の同定を行った。その結果、GβγはGIRKのT238,E240,G241,E242,F243,L333,K339,E350を含む分子側面のサブユニット境界面に結合し、サブユニット間の相対配置を変化させることにより、Gβγ結合面から離れたβH-βIストランド間に位置するGループを含む細胞内ポア表面やN末端領域に構造変化を誘起することが明らかとなった。全長構造中においてGループは膜貫通領域のinner helixと近接し、N末端領域はouter helixに連結していることから、これらの部位に生じた構造変化は膜貫通領域に伝播し、ゲートの開口に寄与し得ると判断した。生体内におけるGPCR-G蛋白質-GIRK複合体形成機構の解明によるGIRK制御機構解明に向けて、Gα_<i3>とRGS4を調製し、(1)RGS4(2)Gα<i3>(3)Gα_<i3>-RGS4(4)Gαβγについて、GIRK細胞内領域を観測対象としたCSP実験を行った。その結果、(1)RGS4(2)Gα_<i3>(3)Gα_<i3>-RGS4において相互作用を示す結果を得たが、(4)Gαβγにおいて相互作用を示す結果は得られなかった。このことは、活性化時にGα_<i3>やRGS4、Gα_<i3>-RGS4がGIRK近傍に集積することを示唆しており、この局在は不活性化したGα_<i3>がGβγを迅速に回収することを可能とするため、チャネル活性の解除に寄与すると考えられる。一方、本研究においてGαβγとGIRKの相互作用は検出されなかったが、両者の相互作用はGIRKの素早い活性化に重要と考えられており、本研究に含まれないGIRKの領域やGα_<i3>の脂質修飾などが関与する可能性があるため、さらなる解析が必要である。

利用NMR方法，我们从三维结构角度进一步阐明了Gβγ诱导的GIRK开/关机制。具体而言，我们完成了GIRK细胞内区域93%的主链酰胺质子的分配，这是GIRK-Gβγ相互作用的NMR分析所必需的，并将其登记在数据库中（BMRB登录号：11067）。基于分配，我们从过渡交叉饱和实验和化学位移扰动（CSP）实验的结果中确定了 GIRK 上的 Gβγ 结合位点以及与结合相关的结构变化区域。结果，Gβγ与GIRK的含有T238、E240、G241、E242、F243、L333、K339和E350的分子一侧的亚基界面结合，并且通过改变亚基之间的相对排列，Gβγ结合表面研究表明，这会引起细胞内孔表面和 N 末端区域的结构变化，包括位于 βH-βI 链之间的 G 环，其位置远离 βH-βI 链。在全长结构中，G环靠近跨膜区的内螺旋，N端区域与外螺旋相连，因此这些位点发生的结构变化会传播到跨膜区，从而导致确定这可能有助于开门。为了通过阐明体内GPCR-G蛋白-GIRK复合物形成的机制来阐明GIRK控制机制，我们制备了Gα_<i3>和RGS4对于i3>-RGS4(4)Gαβγ，我们进行了针对Gα_<i3>-RGS4(4)Gαβγ的CSP实验。 GIRK 细胞内区域。结果，我们获得了表明(1)RGS4(2)Gα_<i3>(3)Gα_<i3>-RGS4中相互作用的结果，但没有表明(4)Gαβγ中相互作用的结果。这表明Gα_<i3>、RGS4和Gα_<i3>-RGS4在激活时聚集在GIRK附近，并且这种定位表明失活的Gα_<i3>快速转移Gβγ，这被认为有助于通道活性的释放。另一方面，虽然本研究中没有检测到Gαβγ和GIRK之间的相互作用，但两者之间的相互作用被认为对于GIRK的快速激活很重要，并且本研究中未包括GIRK区域和Gα_<i3>需要进一步分析，因为可能涉及脂质修饰和其他因素。