G蛋白質によるカリウムチャネル制御機構の構造生物学的および電気生理学的研究

G蛋白钾通道控制机制的结构生物学和电生理学研究

基本信息

批准号：
07J01798
负责人：
横川真梨子
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J01798/
关键词：
イオンチャネル NMR 3量体G蛋白質相互作用解析 G蛋白質

项目摘要

NMR法を用いて、GβγによるGIRK開閉機構の立体構造の観点からの解明をさらに進めた。具体的には、GIRK-Gβγ間相互作用のNMR解析に必要なGIRK細胞内領域の主鎖アミドプロトンの帰属を進めることにより93%の帰属を完了し、データベースに登録した(BMRB accession number:11067)。帰属に基づき、転移交差飽和実験と化学シフト摂動(CSP)実験結果より、GIRK上のGβγ結合部位および結合に伴う構造変化領域の同定を行った。その結果、GβγはGIRKのT238,E240,G241,E242,F243,L333,K339,E350を含む分子側面のサブユニット境界面に結合し、サブユニット間の相対配置を変化させることにより、Gβγ結合面から離れたβH-βIストランド間に位置するGループを含む細胞内ポア表面やN末端領域に構造変化を誘起することが明らかとなった。全長構造中においてGループは膜貫通領域のinner helixと近接し、N末端領域はouter helixに連結していることから、これらの部位に生じた構造変化は膜貫通領域に伝播し、ゲートの開口に寄与し得ると判断した。生体内におけるGPCR-G蛋白質-GIRK複合体形成機構の解明によるGIRK制御機構解明に向けて、Gα_<i3>とRGS4を調製し、(1)RGS4(2)Gα<i3>(3)Gα_<i3>-RGS4(4)Gαβγについて、GIRK細胞内領域を観測対象としたCSP実験を行った。その結果、(1)RGS4(2)Gα_<i3>(3)Gα_<i3>-RGS4において相互作用を示す結果を得たが、(4)Gαβγにおいて相互作用を示す結果は得られなかった。このことは、活性化時にGα_<i3>やRGS4、Gα_<i3>-RGS4がGIRK近傍に集積することを示唆しており、この局在は不活性化したGα_<i3>がGβγを迅速に回収することを可能とするため、チャネル活性の解除に寄与すると考えられる。一方、本研究においてGαβγとGIRKの相互作用は検出されなかったが、両者の相互作用はGIRKの素早い活性化に重要と考えられており、本研究に含まれないGIRKの領域やGα_<i3>の脂質修飾などが関与する可能性があるため、さらなる解析が必要である。

使用NMR，我们从Gβγ的三维结构的角度进一步开发了阐明。具体而言，通过分配GIRK细胞内区域的主链酰胺质子来完成93％的归因，这是GIRK-Gβγ相互作用的NMR分析所必需的，并在数据库中注册（BMRB登录号：11067）。基于分配，从易位交叉饱和实验和化学位移扰动（CSP）实验的结果中鉴定出了GIRK上的Gβγ结合位点和与结合相关的结构变化区域。 As a result, it was revealed that Gβγ binds to the subunit interface of the molecular side including T238, E240, G241, E242, F243, L333, K339, and E350 of GIRK, and by changing the relative arrangement between the subunits, it induces structural changes in the intracellular pore surface and N-terminal region, which contain the G loop located between the与Gβγ结合表面分离的βH-βI链。在全长结构中，G环接近跨膜区域的内螺旋，N末端区域与外螺旋相关，因此确定在这些位点发生的结构变化传播到跨膜区域，并可以为门开口做出贡献。为了阐明在体内GPCR-G蛋白girk络合物形成的机制，制备了gα__<i3>和RGS4的机制，制备了（1）rgs4（2）rgs4（2）gα<i3>（3）gα_____4的GIRK内gα__<i3>和RGS4，并进行了CSP实验。结果，获得了（1）RGS4（2）Gα__<i3>（3）Gα__<i3> -RGS4中相互作用的结果，但是（4）没有显示Gαβγ相互作用的结果。这表明Gα__<i3>，RGS4和Gα__<i3> -RGS4在激活后在Girk附近积聚，并且由于灭活的Gα_______________________的>允许Gβγ的快速恢复，因此人们认为该定位有助于通道活性失活。另一方面，在这项研究中未检测到Gαβγ与GIRK之间的相互作用，但是两者之间的相互作用被认为对Girk的快速激活很重要，因此需要进一步分析，因为这项研究中不包括Girk的区域，而Gα_________________________________________________则是必要的。