酵母ペルオキシソームのマトリクス酵素及び膜タンパクの遺伝子発現調節

酵母过氧化物酶体基质酶和膜蛋白基因表达的调控

• 批准号: 07760084
• 负责人: 阪井 康能
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760084/
• 关键词: fomate dehydrogenase; dihydroxyacetone synthase; peroxisome membrane protein; peroxisome

C. boidiniiにおいて転写レベルでの遺伝子発現を追跡するために、レポーター遺伝子をプロモーター領域の下流に連結したプラスミドを持った形質転換体を作成し、誘導・非誘導などの条件でレポーター遺伝子の酵素活性を測定を行うことにより、簡便にプロモーター活性を追跡する方法を開発した。今回、Saccharomyces cerevisiae PHO5遺伝子をいくつかのペルオキシソームマトリクス酵素及び膜タンパク遺伝子のプロモーター領域に連結した結果、それらの遺伝子発現調節を、簡便にしかもコロニー上で評価できるようになった。C. boidiniiをグルコース培地からメタノール培地へ移すと顕著なペルオキシソームの形成が認められ、マトリクス及び膜タンパクが、順序正しくペルオキシソームへ合成されていることを、ノーザン解析、ウエスタン解析、レポーター遺伝子による発現の追跡を行うことにより明らかした。その結果、これらの調節が、遺伝子発現のレベル、すなわちプロモーターのレベルで行われていることがわかり、遺伝子発現調節機構の存在が示唆された。これまでに本申請者は、C. boidiniiを用いた効率的な異種遺伝子発現系をアルコールオキシダーゼ(AOD1)プロモーターを用いて開発している。同様に、菌体内で大量に発現しているジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、また細胞質酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH1)について、酵素活性、ノーザン解析、ウエスタン解析、レポーターシステムを用いることにより、これらのプロモタ-活性と発現調節について検討を加えた。その結果、特にFDH1プロモーターは、AOD1プロモーターに比較しても強力が活性を持っており、発現調節についてもAOD1プロモーターとは異なった調節機構を持っていることが明らかになった。

为了追踪 C. boidinii 中转录水平的基因表达，我们创建了带有报告基因连接在启动子区域下游的质粒的转化体，并在诱导和非诱导条件下观察报告基因的酶活性我们开发了一种通过测量轻松跟踪启动子活动的方法。这次，通过将酿酒酵母 PHO5 基因连接到几个过氧化物酶体基质酶和膜蛋白基因的启动子区域，我们能够轻松评估菌落中这些基因表达的调节。当C. boidinii从葡萄糖培养基转移至甲醇培养基时，观察到显着的过氧化物酶体形成，并且通过Northern分析、Western分析和使用报告基因的表达跟踪证实基质蛋白和膜蛋白有序地合成为过氧化物酶体。通过执行以下操作已澄清这一点。结果发现，这些调控是在基因表达水平，即启动子水平进行的，提示基因表达调控机制的存在。迄今为止，申请人已经使用醇氧化酶(AOD1)启动子利用C. boidinii开发了有效的异源基因表达系统。同样，在细菌中大量表达的二羟基丙酮合酶（DHAS）和细胞质酶甲酸脱氢酶（FDH1）可以通过酶活性、Northern 分析、Western 分析和报告系统来促进。表达调节。结果表明，特别是FDH1启动子比AOD1启动子具有更强的活性，并且它具有与AOD1启动子不同的表达调控机制。

项目成果

Yasuyoshi SAKAI et al.: "Isolation and characterization of mutants of the methylotrophic yeast, Candida boidinii S2 that are impaired in growth on peroxisome-inducing carbon sources" Bioscience, Bitechnology, and Biochemistry. 59. 869-875 (1995)

Yasuyoshi SAKAI 等人：“甲基营养酵母突变体的分离和表征，博伊丁假丝酵母 S2 在过氧化物酶体诱导碳源上生长受损”生物科学、生物技术和生物化学。

Hideshi YANASE et al.: "Enzymatic preparation of [1,3-^<13>C]dihydroxyacetone phosphate from[^<13>C]methanol and hydroxypyruvate using the methanol-assimilating system of methylotrophic yeasts" Applied Microbiology and Biotechnology. 43. 228-234 (1995)

Hideshi YANASE等人：“使用甲基营养酵母的甲醇同化系统从[^ 13 C]甲醇和羟基丙酮酸酶法制备[1，3-^ 13 C]二羟基丙酮磷酸盐”应用微生物学和生物技术。

Fumihiko SATO et al.: "Synthesis and secretion of tobacco neutral PR-5 protein by transgenic tobacco and yeast" Biochemical and Biophysical Research Communications. 211. 909-913 (1995)

Fumihiko SATO 等人：“转基因烟草和酵母合成和分泌烟草中性 PR-5 蛋白”生物化学和生物物理研究通讯。

Yasuyoshi SAKAI et al.: "The Candida boidinii peroxisomal rembrane protein Pmp30 has a role in peroxisomal proliferation and is functionally homologous to Pmp27 from Saccharomyces cerevisiae" Journal of Bacteriology. 177. 6773-6781 (1995)

Yasuyoshi SAKAI 等人：“博伊丁念珠菌过氧化物酶体膜蛋白 Pmp30 在过氧化物酶体增殖中发挥作用，并且在功能上与来自酿酒酵母的 Pmp27 同源”《细菌学杂志》。