メタノール酵母細胞内動態のビジュアル化とソーティング・エンジニアリング

甲醇酵母细胞内动力学的可视化和分选工程

• 批准号: 12460149
• 负责人: 阪井 康能
• 金额: $ 8.19万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12460149/
• 关键词: メタノール資化性酵母; 細胞内輸送工学; オルガネラ; 蛋白質輸送; 異種遺伝子発現; ペルオキシソーム; 異種遺伝子発現系; Candida boidinii

1. メタノール資化性酵母におけるオルガネラ動態のビジュアル化と応用機能開発(1)代謝及び蛋白質輸送機能メタノール酵母に発達しているペルオキシソーム代謝、特に抗酸化代謝機能に関わる2つの蛋白質、カタラーゼとPmp20について、その生理生化学的機能を明らかにした。特にPmp20については、ペルオキシソームに局在するペルオキシレドキシンとして過酸化脂質を基質としたグルタチオンペルオキシダーゼであることを初めて明らかにし、カタラーゼの持つ抗酸化反応との差異を明確にした(J.Biol.Chem,276,14279)。また、これらの蛋白質のペルオキシソームへの局在化効率には差があることを示し、その差は局在化シグナルとそのレセプターとの相互作用の強さに依存していることがわかった(J.Bacteriol.,183,6372他)(2)ペルオキシソーム分解の分子機構ペルオキシソームの発達した細胞をその不要な培地に移すとペルオキシソームが選択的に分解される。この過程を2重蛍光染色法により1細胞で追跡することにより、液胞が分断化しながらペルオキシソームを包み込みこんで行くことを明らかにした。さらにその過程を支配する20以上のPAZ遺伝子を同定しペルオキシソーム分解の分子モデルを提出した(Genes Cells,7,75他)。(3)蛋白質生産系への開発と応用蛋白質やペルオキシソーム分解に関わるPEP4及びPRB1遺伝子をCandida boidiniiiからクローニングして高蛋白質生産用の宿主を創生した。さらに臨床診断酵素として有用なペルオキシソーム酵素であるD-アミノ酸オキシダーゼの高生産に成功した(Biosci, Biotechnol.Biochem.,65,627;ibid.,66 628)。平成13年度に予定されていた本研究は、申請者が基盤研究(S)を受けることになったため、辞退することになった。しかしながら、その決定通知を受け取るより以前の段階において、上記成果を論文発表するための図表作製に必要な消耗品として、本研究費の一部を充当することになった。

1. 甲醇同化酵母细胞器动力学可视化及应用功能开发 (1) 代谢和蛋白质转运功能 开发甲醇酵母过氧化物酶体代谢，特别是参与抗氧化代谢功能的两种蛋白质过氧化氢酶和Pmp20，并阐明其生理生化功能。特别是，对于Pmp20，我们首次揭示了它是一种以脂质过氧化物为底物的谷胱甘肽过氧化物酶，作为位于过氧化物酶体中的过氧化还原蛋白，并阐明了与过氧化氢酶的抗氧化反应的差异（J.Biol.Chem，276） ，14279）。我们还表明，这些蛋白质对过氧化物酶体的定位效率存在差异，并且这些差异取决于定位信号与其受体之间相互作用的强度（J Bacteriol., 183, 6372 等）(2)过氧化物酶体降解的分子机制 当具有发育的过氧化物酶体的细胞转移到不需要它们的培养基中时，过氧化物酶体被选择性降解。通过使用双荧光染色跟踪单细胞中的这一过程，我们发现液泡碎片并包裹着过氧化物酶体。此外，我们还鉴定了 20 多个控制这一过程的 PAZ 基因，并提出了过氧化物酶体降解的分子模型（Genes Cells、7、75 等）。 (3)蛋白质生产系统的开发和应用从Candida boidiniii中克隆了参与蛋白质和过氧化物酶体降解的PEP4和PRB1基因，以创建高蛋白质生产宿主。此外，我们成功地生产了大量的D-氨基酸氧化酶，一种可用作临床诊断酶的过氧化物酶体酶（Biosci, Biotechnol.Biochem., 65, 627；同上，66 628）。这项原定于 2001 财政年度进行的研究因申请人要进行科学研究而不得不被拒绝（S）。然而，在收到这一决定的通知之前，决定将一部分研究经费分配给用于制作在论文中发表上述结果的图表所需的消耗品。

项目成果

Horiguchi, H. et al.: "Antioxidant System within Yeast Peroxisome: Biochemical and Physiological Characterization of CbPmp20 in the Methylotrophic Yeast Candida boidinii"Journal of Biological Chemistry. 276・17. 14279-14288 (2001)

Horiguchi, H. 等人：“酵母过氧化物酶体中的抗氧化系统：甲基营养酵母 Candida boidinii 中 CbPmp20 的生化和生理特性”《生物化学杂志》276・17（2001 年）。

Komeda, T. et al.: "Construction of Protease-deficient Candida boidinii Strains Useful for Recombinant Protein Production: Cloning and Disruption of Proteinase Agene (PEP4) and Proteinase B gene (PRB1)"Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 66・3. 628

Komeda, T. 等人：“可用于重组蛋白生产的蛋白酶缺陷型博伊丁念珠菌菌株的构建：蛋白酶 A 基因 (PEP4) 和蛋白酶 B 基因 (PRB1) 的克隆和破坏”生物科学、生物技术和生物化学 66・3。 628

阪井康能: "異種タンパク質生産のための"細胞内輸送工学""生物工学会誌. 78(9). 397-401 (2000)

Yasunori Sakai：“异源蛋白质生产的细胞内运输工程”日本生物工程学会杂志78（9）397-401（2000）。

Mukaiyama, H. et al.: "Paz2 and 13 oher PAZ gene products regulate vacuolar engulfment of peroxisomes during micropexophagy"Genes to Cells. 7・1. 75-90 (2002)

Mukaiyama, H. 等人：“Paz2 和其他 13 个 PAZ 基因产物调节微噬菌体吞噬过程中的液泡吞没”Genes to Cells 7·1 (2002)。

Horiguchi, H. et al.: "Peroxisomal Catalase in the Methylotrophic Yeast Candida boidinii: Transport Efficiency and Metabolic Significance"Journal of Bacteriology. 183・21. 6372-6383 (2001)

Horiguchi, H. 等人：“甲基营养酵母假丝酵母中的过氧化氢酶：运输效率和代谢意义”细菌学杂志 183・21（2001）。