メタノール酵母分子育種株によるバイオコンバージョン

利用甲醇酵母分子育种菌株进行生物转化

• 批准号: 06760084
• 负责人: 阪井 康能
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760084/
• 关键词: バイオコンバージョン; 異種遺伝子発現; メタノール資化性酵母; Candida boidinii; adenylate kinase; ATP

本研究では、安価なメタノールの存在により強く誘導される新規な真核生物の異種遺伝子発現系として、本申請者によって開発されたメタノール資化性酵母Candida boidinii発現系を用いたバイオコンバージョンシステムについての基礎研究を行った。まず、C.boidinii AOD1 5'-隣接断片をS.cerevisiae ADK1構造遺伝子の上流に連結しC.boidinii染色体内へ導入して、アデニル酸キナーゼの大量発現を試みた。すると菌体内蛋白質の28%にも及ぶアデニル酸キナーゼがC.boidinii内で大量発現された。また染色体挿入型あるいは自律複製型など様々な種類の形質転換体を作成しその発現制御について検討した結果、先にクローンされたC.boidinii AOD1遺伝子の5'-隣接領域にはAOD1遺伝子の発現制御を司るのに必要十分なcis-配列が存在していることも明らかとなった。さらに、得られたC.boidinii形質転換株の菌体反応を用いてアデノシンを基質としたATP生産を、形質転換株を用いて行い野生株と比較した。野生株ではアデニル酸キナーゼによるAMPからADPへの変換反応が律速となっていたが、形質転換株では、本酵素活性が5000倍から10000倍に増強されているために、培養液当たりのATP生産活性は23倍に増強した。このような形質転換株を用いてpH制御下で基質を添加しながら反応させることにより、45hの反応で230mM(117g/1)のATPを反応液中に蓄積することができた。これらの事実は、単にATPを生産するための手段ではなく、本異種遺伝子発現系が、例えば、高価なATPを添加することなく、他のATP要求性バイオコンバージョン反応に利用できる可能性を示したものである。

在本研究中，我们利用申请人开发的利用甲醇的酵母博伊丁假丝酵母表达系统作为新型真核异源基因表达系统，对廉价甲醇的存在强烈诱导的生物转化系统进行了基础研究。首先，我们尝试通过将 C. boidinii AOD1 5'-侧翼片段连接到酿酒酵母 ADK1 结构基因上游并将其引入 C. boidinii 染色体来大规模表达腺苷酸激酶。结果，占细胞内蛋白质28%的腺苷酸激酶在C. boidinii中大量表达。此外，我们创建了各种类型的转化体，例如染色体插入型和自主复制型，并研究了它们的表达控制。结果，我们发现先前克隆的 C.boidinii AOD1 基因的 5' 侧翼区域控制着表达。 AOD1 基因的表达也表明有足够的顺式序列来控制这一点。此外，使用获得的C.boidinii转化菌株的细胞反应进行使用腺苷作为底物的ATP生产，并与野生菌株进行比较。在野生菌株中，腺苷酸激酶从 AMP 到 ADP 的转化反应是限速的，但在转化菌株中，这种酶活性增强了 5,000 至 10,000 倍，因此每个培养基的 ATP 产量降低了 23 倍。 。使用这样的转化菌株，通过在pH控制下添加底物的同时进行反应，我们能够在45小时的反应中在反应溶液中积累230mM（117g/1）的ATP。这些事实表明，这种异源基因表达系统不仅仅是产生ATP的手段，而且有潜力用于其他需要ATP的生物转化反应，例如，无需添加昂贵的ATP。

项目成果

Sakai,Y.: "Isolation and characterization of mutants of the methylotrophic yeast,Candida boidinii S2 that are impaired in growth on peroxisome-inducing carbon sources." Biosci.Biotech.Biochem.(in press). (1995)

Sakai，Y.：“甲基营养酵母博伊丁假丝酵母 S2 突变体的分离和表征，这些突变体在过氧化物酶体诱导碳源上的生长受到损害。”

Sakai,Y.: "High-level ATP production by a genetically-engineered Candida yeast." Bio/Technology. 12. 291-293 (1994)

Sakai,Y.：“基因工程念珠菌酵母产生高水平 ATP。”

阪井康能: "メチロトロフ酵母Candida boidiniiを用いた異種遺伝子発現とバイオコンバージョンのための新しいシステム 酵母研究のフロントライン 生命科学・医学・産業へのインパクト" 酵母細胞研究会・瑞穂印刷産業, 200 (1994)

Yasuyoshi Sakai：“使用甲基营养酵母 Candida boidinii 进行异源基因表达和生物转化的新系统。酵母研究的前沿。对生命科学、医学和工业的影响。酵母细胞研究组/瑞穗印刷工业，200（1994 年） ) )

Sakai,Y.: "A novel formaldehyde oxidation pathway in methylotrophic yeasts:methylformate as a possible intermediate." FEMS Microbiol.Lett.(in press). (1995)

Sakai，Y.：“甲基营养酵母中一种新的甲醛氧化途径：甲酸甲酯作为可能的中间体。”

阪井康能: "メチロトロフ酵母による遺伝子発現:遺伝子発現実験マニュアル高発現システムによる有用タンパク質の生産" 講談社サイエンティフィック, 280 (1994)

Yasuyoshi Sakai：“甲基营养酵母的基因表达：通过高表达系统生产有用蛋白质的基因表达实验手册”讲谈社科学，280（1994）