遺伝子工学法によるカンキツbrownspot病菌細胞壁分解酵素の病理学的評価

基因工程方法对柑橘褐斑病细胞壁降解酶的病理学评价

• 批准号: 07760049
• 负责人: 秋光 和也
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760049/
• 关键词: カンキツ; brown spot病; 細胞壁分解酵素; 蛋白質分解酵素; ポリガラクツロナーゼ; 糸状菌; アルタナリア属菌; 宿主特異的毒素

植物病原糸状菌の生成する細胞壁分解酵素は,植物への感染時に細胞壁構成成分を分解して菌の細胞内への侵入を容易にし,感染成立のための病原性機能のひとつとして働く可能性をもつ。本研究においては,遺伝子操作のシステムが確立しているAlternaria属菌のカンキツbrown spot病菌を用い,本菌の生成する細胞壁分解酵素の精製,遺伝子のクローニング,およびその遺伝子を用いた遺伝子破壊法による本酵素の病理学的評価を行う。本年度は、蛋白質分解酵素の基質としてスキムミルクを含んだ液体培地にて本菌を静置培養し,そのろ液中に本菌が生成した酵素を純化した。酵素精製においては,各種蛋白純化カラムを用いて高速液体クロマトグラフィーを行なった。本研究費の申請後から現在までにすでに2つの異なるプロテアーゼの単離に成功した。その他,ペクチンを基質として本菌を静置培養し,ろ液に分泌されたポリガラクツロナーゼ(PG)の単離にも成功した。これらの単離酵素は,それぞれSDS-PAGEで単一バンドとして確認された。単離した酵素は,次に酵素分子中の部分的なアミノ酸配列を決定に用いている。先に単離した蛋白質分解酵素の1つについてはN末端からのアミノ酸配列決定を試みたが,N末端がブロックされていたため現在トリプシン処理により本酵素由来のポリペプチド断片をつくり,それら断片からのアミノ酸配列の決定を試みている。配列決定後は,その配列をもとにオリゴヌクレオチドを合成して本酵素遺伝子単離のためのプローブまたはPCRのプライマーとしてもちいる。PGについては,近系糸状菌のPG遺伝子が本菌のPG遺伝子と強くハイブリダイズすることが明らかとなったので,現在これをヘテロロガスなプローブとして用いゲノムライブラリーをスクリーニングしている。これらの結果は,日本植物病理学会全国大会(平成8年春大会)および関西部会(平成7年秋大会)にてすでに発表した。

植物致病真菌在感染植物后降解细胞壁成分产生的细胞壁降解酶，促进细菌进入细胞，并有可能充当建立感染的病原功能。在这项研究中，我们使用了替代属属的柑橘棕色斑点疾病细菌，该细菌具有良好的遗传操纵系统，我们将使用该酶使用该酶使用该基因破坏方法来净化该细菌产生的细胞壁降解酶，并将其克隆该基因和病理学评估。今年，将细菌在含有脱脂牛奶作为蛋白酶的底物的液体培养基中静态培养，并将细菌产生的酶纯化在滤液中。在酶纯化中，使用各种蛋白质纯化柱进行高性能液相色谱。从本研究的资助申请到目前，已经成功隔离了两种不同的蛋白酶。此外，将细菌使用果胶作为底物进行静态培养，并成功分离出滤液中分泌的聚半乳糖醛酸酶（PG）。这些分离的酶中的每一个都通过SDS-PAGE证实为单个带。然后使用分离的酶来确定酶分子中的部分氨基酸序列。对于先前分离的蛋白水解酶之一，我们试图从N末端进行序列，但是由于N末端被阻断，我们现在已经通过胰蛋白酶化制造了从该酶得出的多肽片段，我们正在尝试从这些片段中确定氨基酸序列。测序后，基于序列合成寡核苷酸，并用作分离酶基因或作为PCR引物的探针。关于PG，已经揭示了附近丝状真菌的PG基因与该真菌的PG基因强烈杂交，目前正在使用该真菌作为异源探针筛选基因组文库。这些结果已经在日本植物病理学会全国会议（1996年春季会议）和Kansai小组委员会（1995年秋季会议）上提出。

项目成果

J.D.Walton: "Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions" International Society of Molecular Plant-Microbe Interactions, 415 (1995)

J.D.Walton：“植物-微生物相互作用的分子遗传学进展”国际植物-微生物分子相互作用学会，415（1995）

秋光 和也: "植物感染機構の進化を考える" 日本植物病理学会, 119 (1995)

Kazuya Akimitsu：“考虑植物感染机制的进化”日本植物病理学会，119（1995）

J.D.Walton: "Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases Volume II Eukaryotes" Pergamon, 407 (1995)

J.D.Walton：“植物病害第二卷真核生物的发病机制和宿主特异性”Pergamon，407 (1995)

秋光 和也: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(1)蛋白質分解酵素の純化" 日本植物病理学会報. 61. 615 (1995)

Kazuya Akimitsu：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究（1）蛋白水解酶的纯化”日本植物病理学会会报61. 615（1995）。

秋光 和也: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(2)ポリガラクツロナーゼの精製とその遺伝子のクローニング" 日本植物病理学会報. 62(発表予定). (1996)

秋光一也：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究（2）多聚半乳糖醛酸酶的纯化及其基因的克隆”日本植物病理学会会刊62（待出版）。