タンゼリンbrown spot病菌の宿主特異的毒素生合成の分子機構

橘褐斑病病原菌宿主特异性毒素生物合成的分子机制

• 批准号: 02J00696
• 负责人: 増中 章
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J00696/
• 关键词: Alternaria alternata; カンキツ; Alternaria brown spot病; 宿主特異的毒素; ACT毒素

これまでに、フロリダ産タンゼリンbrown spot病菌からACT毒素生合成遺伝子クラスターの部分領域(33,974bp)を単離し、この領域内に含まれる5つのACT毒素生合成遺伝子は、本毒素部分構造であるデカトリエン酸生合成に関与することを示してきた。また、現在得ている5つの生合成遺伝子が、全て1.9Mbの小型染色体上に座乗していることを明らかにした。そこで次に、ACT毒素に特異的な構造部分に関与する酵素遺伝子群の単離を試みた。始めに、タンゼリンおよびラフレモンの両植物に対して病原性を示すAlternaria alternata BC3-5-1-OS2A株が米国フロリダ州のカンキツ圃場から分離されたので、この菌株について解析を行った。BC3-5-1-OS2A株は,宿主特異的毒素であるACT、ACR両毒素を生産し、それぞれの毒素の感受性品種であるタンゼリンおよびラフレモンの双方に対する病原性を持つ。また、ACTまたはACR毒素生産菌のそれぞれのゲノムに特異的に存在する毒素生合成遺伝子またはDNA配列の双方が、BC3-5-1-OS2A株の小型染色体上に座乗していることを確認した。これらのことから本菌株はACTおよびACR毒素の両生合成遺伝子クラスターを有することが示唆された。そこで,本菌株のゲノムDNAを用いてゲノムBACライブラリーを作製し、ACT毒素生合成遺伝子ACTTRをプローブとしてBACクローン2H2を選抜した。このBACクローン2H2は、ACT毒素生合成遺伝子であるACTT1、2、3、R、5、6を含むことがPCRにより確認された。現在、このBACクローン2H2の挿入ゲノム領域(約100kb)の全塩基配列の決定がすでに終了しており、シーケンス解析により新たな推定ORFが検出されている。これら新たなORFについては、ACT毒素生成菌ゲノムに特異的に存在するかどうかサザン解析を行い、ACT毒素生合成遺伝子クラスターに特異的なORFを決定し、標的遺伝子破壊によりACT毒素生成における各ORFの役割の解明を行っていく。

迄今为止，我们从佛罗里达橘褐斑真菌中分离出了ACT毒素生物合成基因簇的部分区域（33,974 bp），该区域包含的5个ACT毒素生物合成基因就是该毒素的癸三烯部分结构。表明它参与酸的生物合成。他们还透露，目前可用的5个生物合成基因都位于一条1.9Mb的小染色体上。因此，我们接下来尝试分离参与 ACT 毒素特异结构部分的酶基因。首先，从美国佛罗里达州的柑橘田中分离出对橘子和粗柠檬植物均致病的链格孢 BC3-5-1-OS2A 菌株，并对该菌株进行了分析。 BC3-5-1-OS2A菌株产生ACT和ACR毒素，它们是宿主特异性毒素，并且对橘子和粗柠檬（它们是每种毒素的易感品种）具有致病性。另外，已证实ACT或ACR毒素产生菌各自基因组中特异存在的毒素生物合成基因和DNA序列均位于BC3-5-1-OS2A菌株的小染色体上。这些结果表明该菌株具有 ACT 和 ACR 毒素生物合成的基因簇。因此，使用该菌株的基因组DNA构建基因组BAC文库，并使用ACT毒素生物合成基因ACTTR作为探针选择BAC克隆2H2。通过PCR证实该BAC克隆2H2含有ACT毒素生物合成基因ACTT1、2、3、R、5和6。目前，该BAC克隆2H2的插入基因组区域（约100kb）的完整核苷酸序列已被确定，并通过序列分析检测到了一个新的推定ORF。对于这些新的ORF，我们进行了Southern分析以确定它们是否特异存在于ACT毒素产生细菌的基因组中，确定了ACT毒素生物合成基因簇特有的ORF，并确定了ACT毒素生产中的每个ORF是否存在于靶向我们将阐明基因破坏的作用。