標的遺伝子破壊法を用いた病原糸状菌の生成する植物細胞壁分解酵素の病理学的評価

利用靶向基因破坏方法对病原真菌产生的植物细胞壁降解酶进行病理学评价

• 批准号: 08760046
• 负责人: 秋光 和也
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760046/
• 关键词: カンキツ; Brown spot病; 細胞壁分解酵素; エンドポリガラクツロナーゼ; アルカリ性プロテアーゼ; 糸状菌; アルタナリア属菌; 宿主特異的毒素

カンキツbrown spot病菌は,近年多くのカンキツ栽培国で重要な病害となっている。本病の病原性決定因子は宿主特異的ACR毒素と考えられているが,その他の病原,病徴因子については何の報告もない。本研究においては毒素以外の病原,病徴因子として,本菌の分泌する細胞壁分解酵素の単離,生化学的諸性質,遺伝子クローニングおよび遺伝子破壊法による酵素の病理学的評価を目的とした。ポリガラクツロナーゼ(PG)に関する研究では,ヘテロロガスプローブを用いた本菌染色体遺伝子のサザンブロット解析により,本酵素遺伝子は単一である可能性が示された。また本菌の培養ろ液にはPG活性を示す画分は一つしかなく,この画分を単離したところendo型のPGであることが明らかとなった。単離には硫安沈殿,CMsepharose,イオン交換HPLC,ゲルろ過HPLCを用い,培養ろ液2.5Lから約230μgのPGを単離し,精製における比活性は粗抽出液に対して30倍であった。この単離endoPGはSDS-PAGEでの分子量6万,等電点8.8の糖蛋白であり,至適pHは5でKm値とVmax値はそれぞれ0.1mg/ml,4.76*10^<-3>mmol/min/mgであった。本endoPGのN末端アミノ酸配列は,GPDDIYAと決定した。この配列中のDDIYAと,現在までに報告されている糸状菌のendoPG遺伝子のアミノ酸配列情報の相同性検索により得たモチーフNQDDCを基にPCRプライマーを合成した。これらのプライマーを用いて本菌の染色体遺伝子を鋳型にPCRを行ったところ,予測されるサイズである約700bpの遺伝子が増幅され,この遺伝子は先にサザンブロット解析に用いたヘテロロガスプローブと強くハイブリダイズし,染色体遺伝子解析で確認した単一遺伝子と同じ遺伝子であることを確認した。現在この遺伝子を用いて相同組換えを介した遺伝子破壊法が進展中である。また本遺伝子の配列決定,_cDNA,ゲノムライブラリーのスクリーニングも順調に進行している。本菌の分泌するプロテアーゼについても染色体遺伝子解析により少なくとも5つ以上の遺伝子の存在を確認し,ろ液中から5つの酵素活性画分を検出し,このうち3画分を単離した。これらはいずれもアルカリ性プロテアーゼで,一つはセリン型プロテアーゼでプロテア-デKに類することを阻害剤検定で明らかにした。

近年来，柑橘褐斑病已成为许多柑橘种植国家的重要病害。宿主特异性ACR毒素被认为是该病致病的决定因素，但尚无其他致病或症状因素的报道。在本研究中，我们的目的是分离该细菌分泌的作为毒素以外的病原体和疾病症状因素的细胞壁降解酶，并利用各种生化特性、基因克隆和基因破坏方法对这些酶进行病理学评估。在对多聚半乳糖醛酸酶（PG）的研究中，使用异源探针对该真菌的染色体基因进行Southern印迹分析表明该酶基因可能是单个基因。另外，该细菌的培养滤液中只有一个级分显示出PG活性，当分离该级分时，发现它是内型PG。采用硫酸铵沉淀、CMsepharose、离子交换HPLC、凝胶过滤HPLC从2.5L培养滤液中分离出约230μg PG，纯化时比活性是粗提物的30倍。这种分离的endoPG是一种糖蛋白，经SDS-PAGE测定，分子量为60,000，等电点为8.8，最佳pH为5，Km和Vmax值为0.1 mg/ml和4.76*10^<- 3>分别为mmol/min/mg。该endoPG的N端氨基酸序列被确定为GPDDIYA。基于该序列中的DDIYA和通过对迄今为止报道的丝状真菌的endoPG基因的氨基酸序列信息进行同源性检索而获得的基序NQDDC，合成了PCR引物。当使用这些引物和该细菌的染色体基因作为模板进行PCR时，扩增出约700bp的基因，其是预测的大小，并且将该基因与Southern印迹分析中使用的异源探针进行比较。进行了强烈杂交，确认与染色体基因分析所确认的单基因为同一基因。目前，利用该基因通过同源重组进行基因破坏的方法正在进行中。该基因的测序以及cDNA和基因组文库的筛选也进展顺利。对于该细菌分泌的蛋白酶，通过染色体基因分析确认了至少5个基因的存在，并且在滤液中检测到5个酶活性级分，其中分离出3个级分。抑制剂测定表明，这些都是碱性蛋白酶，其中一种是与Proteade K类似的丝氨酸型蛋白酶。

项目成果

一色 淳憲等: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(IV)ポリガラクツロナーゼの諸性質とクローニング" 日本植物病理学会報. 63(発表予定). (1997)

Atsushi Isshiki等：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究（IV）特性和多聚半乳糖醛酸酶的克隆”日本植物病理学会会刊63（待出版）。

Akimitsu K.,et al.: "Molecular Aspects of Pathogenicity and Resistance: Requirement for Signal Transduction" APS Press, 273 (1996)

Akimitsu K. 等人：“致病性和耐药性的分子方面：信号转导的要求”APS Press，273 (1996)

一色 淳憲等: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(III)ポリガラクツロナーゼとその遺伝子クローニング" 日本植物病理学会報. 62(6). 622 (1996)

Atsushi Isshiki等人：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究(III)多聚半乳糖醛酸酶及其基因克隆”日本植物病理学会通报62(6)622(1996)。

Isshiki A.,et al.: "Purification and Characterization of Endopolygalacturonase from Rough Lemon Pathotype of Alternaria alternata" Physiol Mol Plant Pathol. 49(発表予定). (1997)

Isshiki A. 等人：“链格孢粗柠檬致病型的内聚半乳糖醛酸酶的纯化和表征”Physiol Mol Plant Pathol 49（待出版）。

秋光 和也等: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(II)ポリガラクツロナーゼの精製とその遺伝子のクローニング" 日本植物病理学会報. 62(3). 300 (1996)

Kazuya Akimitsu等：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究(II)多聚半乳糖醛酸酶的纯化及其基因的克隆”日本植物病理学会通报62(3)。