核移行シグナルペプチドによって活性化されるGRP94キナーゼの同定と解析

核定位信号肽激活的GRP94激酶的鉴定与分析

基本信息

批准号：
07780642
负责人：
宮田愛彦
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780642/
关键词：
カゼインキナーゼII 核移行シグナルストレス蛋白質 CK2 GRP94 HSP リン酸化ペプチド

项目摘要

蛋白質の核移行は特定のアミノ酸配列が核移行シグナルとして認識されて起こる。また、核移行がリン酸化によって制御される例が転写因子等で報告され、リン酸化と蛋白質の細胞内局在の興味深い関係が示唆される。SV40ラージT抗原の核移行シグナル(PKKKRKVEDP)に相当するペプチド(以下NLS)を合成し、培養細胞の粗抽出液に加えて内在性のキナーゼによる蛋白質のリン酸化をNLSの有無で比較した。分子量約100k,80k,50k,45k等の複数の蛋白質のリン酸化がNLSによって顕著に促進された。細胞内での蛋白質の局在の制御には分子シャペロン(ストレス蛋白質)が深く関与することから、NLSによってリン酸化の亢進する蛋白質と分子シャペロンとの関係を調べた。その結果、分子量約100kの蛋白質はGRP94の抗体によって免疫沈降され、GRP94であることが示された。従って、NLSによって活性が促進され、GRP94を基質とする内在性のキナーゼが存在することが示唆された。そこで、GRP94をキナーゼフリーにまで精製し、NLS存在下に精製GRP94をリン酸化する活性を指標としてL5178Y細胞の抽出液からResourceQ(陰イオン交換カラム),POROS-Heparin, Hydroxylapatite, MonoQの各カラムクロマトグラフィーによって目的のキナーゼを精製した。但し、精製の終段階でこのキナーゼはNLSに依存せずにGRP94をリン酸化するようになった。精製されたキナーゼは銀染色で分子量約43kと27kの2本のバンドからなり、この分子量はカゼインキナーゼII(CKII)のそれと一致した。改めて各カラムクロマトグラフィー上でのCKII活性を特異的な基質ペプチドを用いたアッセイによって追跡すると、両キナーゼの各カラムクロマトグラフィー上での挙動はほぼ一致した。また、別にブタの精巣から完全精製したCKIIはGRP94をNLSに依存せずに良くリン酸化した。更に、部分精製したNLS依存性のキナーゼによるGRP94のリン酸化部位と、精製したCKIIによるGRP94のリン酸化部位は、V8によるペプチドマップでは同じであった。以上のことから、細胞の粗抽出液中ではCKIIがNLS依存的にGRP94をリン酸化していること、またこのNLS依存性はCKIIそのものの性質ではなく、NLSは細胞粗抽出液に存在して精製CKIIには含まれない何らかの抑制性の制御因子を介してGRP94に対するCKIIの活性を制御していることが判った。現在この因子の同定と精製を進めている。

当特定的氨基酸序列被认为是核转运信号时，蛋白质的核转运发生。此外，据报道，由磷酸化控制的核转运的例子是转录因子，这表明磷酸化与蛋白质亚细胞定位之间存在有趣的关系。合成了与SV40大T抗原（PKKKRKVEDP）的核转运信号相对应的肽（NLS），除了在培养细胞的粗提取物中，通过内源激酶的蛋白质磷酸化与NLS的存在或不存在。 NLS显着促进了多种蛋白质的磷酸化，例如分子量，约100K，80K，50K和45K。由于分子伴侣（应激蛋白）深深地参与了细胞中蛋白质的定位，因此我们研究了蛋白质之间的关系，从而增强NLS和分子伴侣蛋白的磷酸化。结果表明，通过GRP94的抗体将分子量约为100 K的蛋白质免疫沉淀，表明它是GRP94。因此，有人提出该活动是由NLS促进的，表明基于GRP94的内源激酶。因此，GRP94被纯化为无激酶，并通过Resourceq（Anion Exchange柱），Poros-Heparin，羟基磷灰石和Monoq柱色谱从L5178Y细胞提取物中纯化L5178Y细胞提取物，从L5178Y细胞的提取物中纯化。但是，在纯化结束时，这种激酶成为GRP94的NLS独立磷酸化。纯化的激酶由两个带有分子量约为43K和27K的带有分子量的条带组成，在银色染色上，这与酪蛋白激酶II（CKII）一致。再次，每列色谱上的CKII活性在使用特定的底物肽上进行测定，两种激酶在每个色谱柱色谱法上的行为一致。此外，CKII完全从猪睾丸中纯化，磷酸化的GRP94很好地依赖于NLS。此外，在具有V8的肽图中，通过部分纯化的NLS依赖性激酶和GRP94的GRP94磷酸化位点的GRP94的磷酸化位点相同。从以上发现，CKII在粗细细胞提取物中以NLS依赖性方式磷酸化GRP94，并且这种NLS依赖性的性质并不是CKII本身的性质，并且NLS通过某些抑制性调节因子在某些抑制性调节因子中调节CKII对GRP94的活性，而不是在某种抑制性的调节因子中，而不是cki Incrude Cress提取的CKII含有Purified CKII。当前，该因素的识别和纯化正在进行中。