熱ショック蛋白質HSP90のSV40ラージT抗原との複合体形成の解析

热休克蛋白HSP90与SV40大T抗原复合物形成分析

基本信息

批准号：
05858105
负责人：
宮田愛彦
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

SV40のLargeT抗原(LT)は、ダブルヘキサマーの多機能酵素である。またLTはHSP70と複合体を形成することから、その高次構造形成にはシャペロン蛋白質の関与が考えられる。そこで、HSP90が細胞内でLTと複合体を形成してLTの局在・高次構造形成・活性等を制御する可能性を考え、以下の実験結果を得た。LTとHSP90とのSDS-PAGE上の分子量はほぼ同一であった。そこで、SV40でトランスフォームした細胞株とそれぞれの親細胞株の粗抽出液から、LTとHSP90を免疫沈降し、免疫複合体に含まれる蛋白質をWestern blottingによって解析した。その結果、COSなどのLT発現細胞でHSP90を免疫沈降するとLTが、またLTを免疫沈降するとHSP90が、共沈降されることがわかった。この共沈降は、LTを発現していないCV1、HeLa細胞では観察されなかった。p53とHSP90とも共沈降は観察されず、また予めP53をimmuno-depleteした細胞粗抽出液でもHSP90とLTとの共免疫沈降が観察された。このことから、HSP90とLTの複合体形成にはp53は無関係であると結論された。HSP90はHSP70やカゼインキナーゼII(CKII)とも複合体を形成している。一方 LTもp53もHSP70と複合体を形成し、またLTはCKIIの基質でありp53とCKIIは共免疫沈降することが知られている。おそらく細胞内でこれらの多数の蛋白質が様々な組み合わせで複合体を形成していると考えられる。HSP90のシャペロン様機能を調べるため、HSP90とLTとを精製し、in vitroの再構成の実験を試みた。LTは、温度・ATP依存的にmonomerから6-merを形成した。比較的低温ではHSP90の存在下でATP依存性のLTの6-mer形成が促進された。これらの結果は、細胞内でLTは合成後一過的にHSP90と相互作用して活性型の6-mer形成をしている可能性を示唆している。LTのDNA結合能に対してはHSP90を単にin vitroで加えただけでは影響が見られなかった。

SV40的Larget抗原（LT）是双重六聚体的多功能酶。此外，由于LT与HSP70形成复合物，因此伴侣蛋白的参与可能发生在其高阶结构的形成中。因此，我们认为HSP90在细胞中与LT形成复合物来调节LT的定位，高阶结构的形成和LT活性，并获得以下实验结果。 SDS-PAGE上LT和HSP90的分子量几乎相同。因此，LT和HSP90从SV40转化的细胞系和每个母细胞系的粗提取物中免疫沉淀，并通过蛋白质印迹分析免疫复合物中包含的蛋白质。结果，发现HSP90在表达LT的细胞（例如COS）中的免疫沉淀会导致LT的重新沉淀，并且LT的免疫沉淀会导致HSP90的共沉淀。在未表达LT的HeLa细胞中未观察到这种共沉淀。在p53和Hsp90之间未观察到共沉淀，并且在先前先前被免疫消耗的p53的粗细细胞提取物中也观察到Hsp90和LT之间的共免疫沉淀。这得出的结论是，p53与HSP90和LT复合物的形成无关。 HSP90还形成了HSP70和酪蛋白激酶II（CKII）的复合物。同时，LT和p53均与Hsp70形成复合物，并且LT也被称为CKII的底物，P53和CKII Co-rumunoprecipitate。这些蛋白质中的许多可能在细胞内的各种组合中形成复合物。为了研究HSP90的类伴侣样功能，我们纯化了HSP90和LT，并尝试了体外重构实验。 LT以温度-ATP的方式从单体形成6-MER。在相对较低的温度下，在HSP90的存在下促进了依赖ATP的LT 6-MER形成。这些结果表明，在合成后，细胞内LT可能会瞬时与HSP90相互作用，形成6-MER的活性形式。 LT的DNA结合能力不受简单地在体外添加HSP90的影响。