網膜における代謝型グルタミン酸受容体-G蛋白質共役の解析

视网膜代谢型谷氨酸受体-G蛋白偶联分析

基本信息

批准号：
07780579
负责人：
吉川知志
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1993年に中西らがラット網膜より新たな代謝型グルタミン酸受容体遺伝子、mGluR6を単離し塩基配列を明らかにした。このmGluR6産物は網膜に特異的に発現しており、翻訳産物を発現させた培養細胞はAPBに対して強い応答性を示したことから、mGluR6がオン型双極細胞のグルタミン酸受容体の有力な候補と考えられた。そこで、mGluR6蛋白質の分子的実体を調べる上での有力なツールとして、特異的な抗ペプチド抗体を作製を試みた。C末端の14残基を抗原部位として選び、N端にシステインを加えた合計15アミノ酸よりなる1本鎖ペプチドおよび、キャリアーとしてmultiple antigen peptide(MAP)を直接導入した合成ペプチドを合成した。得られた合成ペプチドをMAPペプチドは直接、1本鎖ペプチドはシステインを介してキャリアー蛋白質と結合させたものを数種類合成し、それぞれ数匹のウサギに免疫した。得られた抗血清を抗原ペプチドを用いたELISAおよびウシ網膜膜標品を用いたウエスタンブロットにより評価した。いずれの抗血清も満足のいく特異性が得られなかったため、さらに抗原固定化カラムによる特異抗体の精製を行った。抗血清の50%飽和硫安沈殿画分を1本鎖ペプチドを結合したセファロース4Bカラムに添加した後、4M塩化マグネシウムにより溶出した画分を精製抗体とした。以上のようにして作成した数種の精製抗体を用いてmGluR6蛋白質の検出を行った。このうち1つの抗体により約100kDaの単一のバンドが検出された。この蛋白質の分子量は遺伝子の塩基配列より推定されるラットのmGluR6受容体の分子量95kDaとほぼ一致しており、本抗体がmGluR6受容体を特異的に認識するものであると考えられた。本抗体を用いた、網膜切片の組織染色や、免疫沈降法によるmGluR6受容体蛋白質の単離などが今後の検討課題となろう。

1993年，纳卡尼什（Nakanishi）和其他人从大鼠视网膜中分离出一种新的代谢谷氨酸受体基因mglur6，并揭示了碱基序列。该MGLUR6产物在视网膜中特别表达，表达翻译产物的培养细胞对APB表现出强烈的响应能力，使其成为双极细胞中谷氨酸受体的潜在候选者。因此，我们试图生成特定的抗肽抗体，作为研究MGLUR6蛋白分子实体的强大工具。一个由总共15个氨基酸组成的单链肽，在c-末端添加了14个残基，并将多种抗原肽（MAP）直接引入作为载体的合成肽中，合成了多种肽。直接从MAP肽中合成了几种类型的合成肽，单链肽通过半胱氨酸与载体蛋白结合，并且几只兔子每个兔子均被免疫。使用抗原肽使用牛视网膜膜制剂评估了ELISA所产生的抗血清。由于未从任何抗血清获得令人满意的特异性，因此使用抗原毫米固定柱进一步纯化了特异性抗体。将50％饱和硫酸铵沉淀的抗血清量加入含有单链肽的Sepharose 4B柱中，然后将用4m氯化镁洗脱的馏分用作纯化抗体。使用以上方式制备的几种纯化抗体检测到MGLUR6蛋白。这些抗体之一检测到一个大约100 kDa的单个带。该蛋白的分子量与大鼠MGLUR6受体的分子量几乎相同，该蛋白是从基因的碱基序列估计的，并且认为该抗体特异性地识别了MGLUR6受体。使用该抗体和通过免疫沉淀分离MGLUR6受体蛋白的视网膜切片的组织染色将是一个考虑因素。