光情報伝達における受容体-Gタンパク質間の相互作用のリアルタイム測定

光转导中受体-G 蛋白相互作用的实时测量

基本信息

批准号：
08780631
负责人：
吉川知志
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、EV-R(ダイキン工業社製)ならびにIAsys (Fisions社製)を使用し、タコ視細胞膜より精製したロドプシンと、シグナルトランスデューサーとしてロドプシンと共役するG蛋白質(G_q)との相互作用のリアルタイム測定を試みた。EV-Rは反応槽に固相化した蛋白質と蛍光標識した蛋白質との相互作用を蛍光法で測定する。本研究ではロドプシンを固相化し、G_qαを蛍光標識する方法をとった。蛍光標識試薬には蛋白質のアミノ基と反応するCy5 (Ex max=649nm、Em max=670nm、Amersham社製)を用いた。標識反応時のG_qαとCy5のモル比は1 : 8、反応条件はHepes (pH8.0)バッファー中で10℃、2時間とした。得られたCy5-G_qα標品は、標識効率が1 : 1、GTPγS結合の残存活性は約40%であった。メーカーによる標準的な条件に従いロドプシンを固相化した反応槽を用いてCy5-G_q添加時の結合シグナルを測定したところ、ロドプシンの固相化量に依存した強度のシグナルが得られた。このシグナルは、Cy5-G_qαを変性させると消失し、また過剰量の比標識G_qαや非固相化ロドプシンの同時添加により競合的に減弱されることより、2蛋白質間の特異的な相互作用を反映するものと考えられる。結合シグナルは至適条件(pH6.5)では3分で飽和に達し、GTPγS結合実験の結果とよく一致した。光照射によるロドプシンの活性化に伴うシグナル変化については予備的実験の段階であり、期待した結果はまだ得られていない。結合シグナルは測定溶液中の界面活性剤や塩に大きく影響されるため、光応答を解析するための至適条件の検索が目下の課題である。EV-Rとは異なりIAsysは非標識の蛋白質間の相互作用を測定する。EV-Rと同様に反応槽にロドプシンを固相化し、G_qを添加して結合シグナルを測定した。ロドプシンの固相化法や測定溶液組成を始め、測定諸条件の検討を行ったが、反応槽へのG_qの非特異的結合が多く期待した結果を得るには至らなかった。現在はタコ視細胞膜を直接固相化し、膜上での両者の相互作用を測定する方法を検討している。

在这项研究中，我们试图测量使用EV-R（Daikin Industries）和IASYS（Fisions）将章鱼光蛋白纯化的视紫红质纯化与Rhodopsin（g_q）的相互作用。通过荧光测量固定在反应器中的蛋白质和荧光标记的蛋白质之间的相互作用来测量EV-R。在这项研究中，我们使用了一种固定视紫红质和荧光标记G_Qα的方法。当使用荧光标记试剂（EX MAX = 649 nm，EM MAX = 670 nm，由Amersham制造）与蛋白质的氨基反应。标记反应期间G_Qα与CY5的摩尔比为1：8，在HEPES（pH 8.0）缓冲液中将反应条件设置为10°C。获得的CY5-G_Qα制备的标记效率为1：1，GTPγS结合的残留活性约为40％。当使用一种反应容器根据制造商的标准条件固定二红蛋白的反应容器在CY5-G_Q添加时测量结合信号时，获得了依赖于视旋蛋白杂质质量量的信号。当CY5-G_Qα变性时，该信号消失，并通过同时添加过量的特定标记的G_Qα或非毫米型若愿蛋白而竞争地减弱，从而反映了两种蛋白质之间的特定相互作用。结合信号在最佳条件（pH 6.5）下在3分钟内达到饱和度，这与GTPγS结合实验的结果非常吻合。通过光照射激活视紫红质有关的信号变化是在初步实验的阶段，尚未获得预期的结果。由于结合信号在测量解决方案中受到表面活性剂和盐的影响很大，因此寻找最佳条件以分析光呼应是一个问题。与EV-R不同，IASYS测量未标记蛋白之间的相互作用。将视紫红质固定在反应容器中的方式与EV-R中的方式相同，并添加G_Q以测量结合信号。尽管检查了各种测量条件，包括二紫红蛋白的固定方法和测量溶液的组成，但研究了各种条件，但是G_Q与反应容器的非特异性结合较大，并且没有实现预期的结果。当前，我们正在考虑直接固定章鱼光感受器膜并测量两者在膜上的相互作用的方法。