アスピリン非感受性プロスタグランジン合成酵素の遺伝子導入による基質プールの評価

通过阿司匹林不敏感的前列腺素合酶的基因导入来评估底物库

基本信息

批准号：
07772197
负责人：
堀隆光
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Setsunan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロスタグランジンは、生殖・炎症・血管系など様々な場面において、多様な生理作用を持っていることが知られている。プロスタグランジン生合成系における中心的な酵素はプロスタグランジンH合成酵素(PGHS)であり、PGHSはアスピリンや非ステロイド系抗炎症剤のターゲットとしても知られている。真核細胞においては、2種のPGHSのアイソザイム、PGHS-1とPGHS-2が存在する。両酵素の一次構造のホモロジーは60%で、VmaxとKmは両酵素ではほぼ同じ値を示す。両酵素間の最も大きな相違は発現制御の違いであるが、この二つの酵素の生理機能の相違はいまだ明確ではない。本研究は、両酵素が利用しうる基質プールに着目して両者の生体における寄与を明らかすることを目的とした。実験の第一過程として、アスピリン非感受性のPGHS-1とPGHS-2の遺伝子を安定的に含有し、しかもこれらのPGHSの発現を任意にオン/オフできる細胞を構築することを試みた。本研究で用いたベクターは、GossenとBujardによって樹立されたプラミスド系である。これは、テトラサイクリンオペロンに基づいた発現誘導システムで、2段階に発現が制御される。まず、ハイブリッド転写因子tet/vp16を含むpUHD15-1をハイグロマイシン耐性プラミスドpY3と共にNIH3T3細胞にトランスフェクションし、活性化因子tTAを構成的に産生する細胞を2株単離できた。次に、これらの細胞にアスピリン非感受性に修飾したPGHS遺伝子、PGHS-1-S532AとPGHS-2-S516Aのいずれかとネオマイシン耐性プラスミドpSV2Neoをコトランスフェクションし、培地からのテトラサイクリン除去により、PGHS-1-S532AとPGHS-2-S516Aの発現を誘導できる細胞クローンを探索した。しかし、第一のトランスフェクションで単離された2つの株のどちらに第二のトランスフェクションを行っても、目的タンパクの発現を誘導できる細胞株は得られなかった。原因は不明であるがプラスミドと細胞の組み合わせに問題がある可能性があり、次回は、親株となる細胞株NIH3T3を変更して同様の実験を行う予定である。これらの細胞が得られた後、さらに実験を進めたい。

已知前列腺素在各种情况下具有多种生理作用，例如生殖、炎症和血管系统。前列腺素生物合成系统中的核心酶是前列腺素H合酶（PGHS），PGHS也被称为阿司匹林和非甾体类抗炎药的作用靶点。在真核细胞中，存在两种 PGHS 同工酶：PGHS-1 和 PGHS-2。两种酶的一级结构同源性为60%，两种酶的Vmax和Km值几乎相同。两种酶最大的区别在于表达调控的差异，但这两种酶的生理功能差异目前尚不清楚。本研究的目的是通过关注两种酶可以使用的底物库来阐明这两种酶对生命体的贡献。作为实验的第一步，我们试图构建稳定含有阿司匹林不敏感的PGHS-1和PGHS-2基因的细胞，并且这些PGHS的表达可以随意打开和关闭。本研究使用的载体是Gossen和Bujard建立的pramisid系统。这是基于四环素操纵子的表达诱导系统，表达分两步控制。首先，我们将含有杂合转录因子 tet/vp16 的 pUHD15-1 与潮霉素抗性 pramid pY3 一起转染到 NIH3T3 细胞中，并能够分离出两种组成型产生激活剂 tTA 的细胞系。接下来，将这些细胞与新霉素抗性质粒 pSV2Neo 和修饰为阿司匹林不敏感的 PGHS 基因 PGHS-1-S532A 或 PGHS-2-S516A 和 PGHS-1 共转染，我们搜索了可以诱导的细胞克隆。 -S532A和PGHS-2-S516A的表达。然而，无论将第一次转染中分离的两种菌株中的哪一种进行第二次转染，都无法获得能够诱导目的蛋白表达的细胞系。虽然原因不明，但可能是质粒与细胞的结合存在问题，下次我们计划使用不同的细胞系NIH3T3作为亲本株进行类似的实验。获得这些细胞后，我想进行进一步的实验。