Cu,Zn-スーパーオキサイドディスムターゼの変異と筋萎縮性側索硬化症

铜、锌超氧化物歧化酶突变与肌萎缩侧索硬化症

基本信息

批准号：
06770102
负责人：
藤井順逸
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝性の筋萎縮性側索硬化症(ALS)の患者ではCu,Zu-SOD遺伝子(SOD1)に変異をが報告されているが、日本人の2家系に新しい遺伝子変異を見い出した。しかし、SOD1に変異をもつALSの患者では、赤血球中のSOD活性が低下しているが、それが変異酵素の比活性の低下によるものか、それとも酵素の不安定さを反映した結果なのか明らかではなかった。そこで、この点を明確にするために哺乳動物により近い昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを用いて遺伝子導入し、発現されたリコンビナントSODの酵素学的性質を調べた。野生型Cu,Zu-SODをまず発現させたところ、大量のタンパク質の産生が認められたものの活性は検出できなかった。しかし、培地にCuを添加することによって酵素活性の回復が認められた。この産生系では昆虫細胞中の可溶性タンパク質の約1/3がCu,Zu-SODとなるため、産生されたリコンビナント酵素をイオン交換とゲルろ過カラムによって容易に精製できた。同様にして三種類の変異Cu,Zu-SODを発現させ精製したところ、Gly^<41>→Asp、His^<43>→Argはそれぞれ正常の約47%と66%の活性を示し、Gly^<85>→Argでほぼ100%の活性を有していた。さらに精製酵素を用いて、活性低下の原因が酵素の安定性の低下を反映していることを明らかにした。こうしたCu,Zu-SODの活性低下によるO_2の蓄積は、生体におけるFenton反応を加速し、反応性の高いヒドロキシラジカルの産生を促す結果、運動神経の傷害を起こすものと考えられる。

据报道，遗传性肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 患者存在 Cu,Zu-SOD 基因 (SOD1) 突变，但我们在两个日本家庭中发现了新的基因突变。然而，在SOD1突变的ALS患者中，红细胞中的SOD活性降低，但尚不清楚这是由于突变酶的比活性降低还是酶不稳定的反映。 t。因此，为了阐明这一点，我们使用杆状病毒载体将基因导入更接近哺乳动物的昆虫细胞中，并研究了表达的重组SOD的酶学性质。野生型Cu,Zu-SOD首次表达时，产生大量蛋白质，但检测不到活性。然而，通过向培养基中添加Cu，酶活性得以恢复。在该生产系统中，昆虫细胞中大约三分之一的可溶性蛋白转化为Cu,Zu-SOD，因此所产生的重组酶可以使用离子交换和凝胶过滤柱轻松纯化。当三种类型的突变体Cu、Zu-SOD被类似地表达和纯化时，Gly^<41>→Asp和His^<43>→Arg分别显示出正常活性的约47%和66%，并且Gly^<85> →Arg 几乎具有 100% 的活性。此外，使用纯化的酶，他们发现活性降低的原因反映了酶稳定性的降低。 Cu、Zu-SOD活性降低导致O_2积累，被认为会加速体内芬顿反应，促进高反应性羟基自由基的产生，导致运动神经损伤。