Cu,Zn-スーパーオキサイドディスムターゼの変異と筋萎縮性側索硬化症

铜、锌超氧化物歧化酶突变与肌萎缩侧索硬化症

基本信息

批准号：
06770102
负责人：
藤井順逸
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝性の筋萎縮性側索硬化症(ALS)の患者ではCu,Zu-SOD遺伝子(SOD1)に変異をが報告されているが、日本人の2家系に新しい遺伝子変異を見い出した。しかし、SOD1に変異をもつALSの患者では、赤血球中のSOD活性が低下しているが、それが変異酵素の比活性の低下によるものか、それとも酵素の不安定さを反映した結果なのか明らかではなかった。そこで、この点を明確にするために哺乳動物により近い昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを用いて遺伝子導入し、発現されたリコンビナントSODの酵素学的性質を調べた。野生型Cu,Zu-SODをまず発現させたところ、大量のタンパク質の産生が認められたものの活性は検出できなかった。しかし、培地にCuを添加することによって酵素活性の回復が認められた。この産生系では昆虫細胞中の可溶性タンパク質の約1/3がCu,Zu-SODとなるため、産生されたリコンビナント酵素をイオン交換とゲルろ過カラムによって容易に精製できた。同様にして三種類の変異Cu,Zu-SODを発現させ精製したところ、Gly^<41>→Asp、His^<43>→Argはそれぞれ正常の約47%と66%の活性を示し、Gly^<85>→Argでほぼ100%の活性を有していた。さらに精製酵素を用いて、活性低下の原因が酵素の安定性の低下を反映していることを明らかにした。こうしたCu,Zu-SODの活性低下によるO_2の蓄積は、生体におけるFenton反応を加速し、反応性の高いヒドロキシラジカルの産生を促す結果、運動神経の傷害を起こすものと考えられる。

在遗传性肌萎缩性侧索硬化症患者（ALS）患者中，已经报道了Cu和Zu-Sod基因（SOD1）中的突变，但是在两个日本家庭中发现了新的遗传突变。然而，患有SOD1突变的ALS患者在红细胞中的SOD活性降低，但尚不清楚这是由于突变酶的特异性活性降低，还是反映酶不稳定的结果。为了澄清这一点，我们使用杆状病毒载体将基因转导离哺乳动物接近哺乳动物，并研究了表达的重组SOD的酶促特性。当野生型Cu首先表达ZU-SOD时，观察到大量蛋白质产生，但无法检测到活性。但是，通过将CU添加到培养基中来恢复酶活性。在该生产系统中，昆虫细胞中约有三分之一的可溶性蛋白是Cu，Zu-Sod，因此可以通过离子交换和凝胶过滤柱轻松纯化产生的重组酶。同样，三个突变的Cu和Zu-SOD被表达和纯化，Gly^<41>→ASP和他的^<43>→ARG分别显示出正常活动的大约47％和66％，而Gly^<85>→ARG→ARG具有几乎100％的活性。此外，使用纯化的酶来揭示活动减少的原因反映了酶稳定性的降低。由于Cu和Zu-Sod活性的降低，O_2的积累加速了生物体中的Fenton反应，促进了高反应性羟基自由基的产生，并被认为会导致运动神经损伤。