花成誘導特異的遺伝子のクローニングと花成ホルモン検定系への応用

花诱导特异性基因的克隆及其在开花激素测定系统中的应用

• 批准号: 06760106
• 负责人: 鈴木 義人
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760106/
• 关键词: 花成誘導; 花芽誘導; 花成ホルモン; ディファレンシャルスクリーニング; サブトラクション; ディファレンシャルディスプレー

本研究は花成誘導条件下に置かれたアサガオの茎頂で特異的に転写が誘導される遺伝子のクローニングを通し、花成誘導物質の検出系を確立することを目的としている。これまでの経過は以下の通りである。1.微量(数mg)の日長誘導(DK)および非誘導(NB)の茎頂からそれぞれcDNAを調製した。cDNAの両端にアダプターを繋ぎ、その配列を利用してPCRにより増幅したcDNAを材料に、両方のcDNAからお互いに6回のサブトラクションを行った(Wang and Brown 1991)。得られたDKおよびNBのcDNAはお互いにハイブリダイズせず、それぞれの材料で異なるcDNAの濃縮が確認された。しかしながら、濃縮された遺伝子をクローン化し詳細な検討を行ったところ、この濃縮が最初のPCR後のcDNAの存在比は反映するが、PCR前のcDNAの存在比は必ずしも反映していないことが判明した。現在PCRの条件の再検討を行っている。2.ディファレンシャルスクリーニングに変わる方法として最近用いられるようになっているディファレンシャルディスプレー法(Liang and Pardee 1992)を用いた誘導遺伝子の検索を行った。RNAテンプレートに対し、dT_<12>MNと特定の10merをプライマーとし、_<35>S-dATP存在下でRT-PCRを行い、反応物をシークエンスゲルで分離後、X線フィルム上でバンドの濃さを比較した。プライマーの組み合わせごとに、およそ数十のバンドが検出され、その中にはDKとNB間で明らかな差の見られるバンドも含まれていた。このようなバンドをゲルから回収し、再びPCRを行うことで当該遺伝子が増幅されることを確認した。現在、新たに調製した材料を用いた追試験を行っており、今後バンドのパターンに再現性があるものを特定した上でクローン化し、ノーザン解析を行う予定である。

本研究的目的是通过克隆在开花诱导条件下牵牛花茎尖特异诱导转录的基因，建立诱导开花物质的检测系统。目前进展如下。 1. 从少量（数毫克）光周期诱导（DK）和非诱导（NB）芽尖制备 cDNA。将接头连接到 cDNA 的两端，并使用该序列通过 PCR 扩增 cDNA，并将两个 cDNA 相互减去六次（Wang 和 Brown 1991）。获得的DK和NB cDNA彼此不杂交，并且在每种材料中证实了不同的cDNA富集。然而，当对富集的基因进行克隆和详细检查时，发现这种富集反映了第一次PCR后的cDNA丰度比，但不一定反映PCR前的cDNA丰度比。我们目前正在重新检查 PCR 条件。 2.我们使用差异显示方法（Liang and Pardee 1992）寻找诱导基因，该方法最近已被用作差异筛选的替代方法。在存在_ 35 S-dATP的情况下，使用dT_ 12 MN和特定的10聚体作为引物对RNA模板进行RT-PCR。在测序凝胶上分离反应产物后，在X-上分离条带。射线胶片的密度进行了比较。每个引物组合检测到大约几十个条带，包括 DK 和 NB 之间具有明显差异的条带。通过从凝胶中收集这样的条带并再次进行PCR，可以确认所关注的基因被扩增。我们目前正在使用新制备的材料进行额外的测试，我们计划识别那些具有可重复带模式的材料，克隆它们，并进行 Northern 分析。