花成誘導特異的遺伝子のクローニングと花成ホルモン検定系への応用

花诱导特异性基因的克隆及其在开花激素测定系统中的应用

• 批准号: 06760106
• 负责人: 鈴木 義人
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760106/
• 关键词: 花成誘導; 花芽誘導; 花成ホルモン; ディファレンシャルスクリーニング; サブトラクション; ディファレンシャルディスプレー

本研究は花成誘導条件下に置かれたアサガオの茎頂で特異的に転写が誘導される遺伝子のクローニングを通し、花成誘導物質の検出系を確立することを目的としている。これまでの経過は以下の通りである。1.微量(数mg)の日長誘導(DK)および非誘導(NB)の茎頂からそれぞれcDNAを調製した。cDNAの両端にアダプターを繋ぎ、その配列を利用してPCRにより増幅したcDNAを材料に、両方のcDNAからお互いに6回のサブトラクションを行った(Wang and Brown 1991)。得られたDKおよびNBのcDNAはお互いにハイブリダイズせず、それぞれの材料で異なるcDNAの濃縮が確認された。しかしながら、濃縮された遺伝子をクローン化し詳細な検討を行ったところ、この濃縮が最初のPCR後のcDNAの存在比は反映するが、PCR前のcDNAの存在比は必ずしも反映していないことが判明した。現在PCRの条件の再検討を行っている。2.ディファレンシャルスクリーニングに変わる方法として最近用いられるようになっているディファレンシャルディスプレー法(Liang and Pardee 1992)を用いた誘導遺伝子の検索を行った。RNAテンプレートに対し、dT_<12>MNと特定の10merをプライマーとし、_<35>S-dATP存在下でRT-PCRを行い、反応物をシークエンスゲルで分離後、X線フィルム上でバンドの濃さを比較した。プライマーの組み合わせごとに、およそ数十のバンドが検出され、その中にはDKとNB間で明らかな差の見られるバンドも含まれていた。このようなバンドをゲルから回収し、再びPCRを行うことで当該遺伝子が増幅されることを確認した。現在、新たに調製した材料を用いた追試験を行っており、今後バンドのパターンに再現性があるものを特定した上でクローン化し、ノーザン解析を行う予定である。

这项研究旨在通过克隆一个基因，该基因在花朵诱导条件下的早晨荣耀的茎尖上特异性转录来建立诱导剂的检测系统。到目前为止的进展如下：1。通过分别为光周期（DK）和不可诱导（NB）茎尖的痕量（几毫克）制备cDNA。将适配器连接到cDNA的两端，并使用pCR使用序列作为材料进行扩增的cDNA，将两个cDNA彼此减去六次（Wang and Brown 1991）。 DK和NB的最终cDNA并未互相杂交，并且为每种材料确认了不同的cDNA浓度。但是，当克隆富集的基因并进行详细研究时，发现这种富集反映了初始PCR后cDNA的丰度比，但不一定是PCR前cDNA的丰度比。我们目前正在重新审查PCR条件。 2。我们使用差分显示方法（Liang and Pardee 1992）搜索了诱导基因，该方法最近已成为一种被用作替代差异筛选的方法。使用DT_ <12> Mn在_ <35> S-DATP的情况下将RNA模板和特定10mer作为引物进行RT-PCRCT，然后在序列凝胶上分离反应后，在X射线膜上比较带密度。对于每个引物组合，检测到大约数十个频带，包括DK和NB之间明显差异的条带。从凝胶中收集该频带，然后再次进行PCR，以确认该基因已扩增。我们目前正在使用新准备的材料进行补充测试，将来我们计划识别可再现的带模式并克隆它们并进行北方分析。