植物鉄輸送物質2′-デオキシムギネ酸の生合成酵素の単離

植物铁转运物质2-脱氧麦根酸生物合成酶的分离

基本信息

批准号：
06760064
负责人：
馬建鋒
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Suntory Institute for Bioorganic Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

イネ科植物の鉄獲得物質のうち、2′-デオキシムギネ酸(DMA)は最初に生合成されるキ-物質である。本研究はDMAの生合成経路の解明と生合成酵素の単離を目的とし、以下の成果を得た。なお実験系をシンプルにするために、DMAだけを生合成する小麦(品種農林61号)を実験材料とした。1.まずは今まで推定された生合成経路について検討した。L-メチオニン(Met)とDMAの間の中間体と思われるMetの二量体と三量体(^<13>C標識)を化学合成し、取り込み実験を行った。その結果、両化合物ともDMAに取り込まれなかった。この結果は今まで推定された生合成経路の可能性を否定した。2.上記の経路を明らかにするために、最初の前駆体であるMetがDMAへ変換されるとき、分子中の各原子の変化を調べることにした。^<13>C,^<15>N,^2H標識のMetを用いて調べた結果、Metの2位の^2HがDMAへ変換されるとき、3分子とも消失したが、他の原子はそのままDMAに取り込まれた。この結果はazetidine-2-carboxylic acidが中間体である可能性を示唆している。そこでこの結果にもとづいて、新たな生合成経路を提示した。3.DMAの生合成がメチオニンサイクルと共役していることをつきとめた。4.DMA生合成酵素を単離するために、鉄欠乏処理した小麦の根を用いて、粗酵素の調製を行った。〔1-^<13>C〕Metを基質とし、HPLCとMASSを組み合わせた検出方法で、DMA生合成酵素のアッセイを試みたが、活性が低く、酵素の単離に至らなかった。5.DMA生合成酵素をコードする遺伝子を単離するために、鉄添加と無添加で処理した小麦の根を用いて、cDNAライブラリーを作製した。現在differential hybridizationを用いてスクリーニングを行っている。

在草类的铁获取物质中，2'-脱氧麦根酸（DMA）是第一个生物合成的关键物质。本研究旨在阐明DMA的生物合成途径并分离生物合成酶，获得以下结果。为了简化实验体系，采用仅生物合成DMA的小麦（品种农林61号）作为实验材料。 1. 首先，我们检查了迄今为止估计的生物合成途径。我们化学合成了Met二聚体和三聚体(^ 13 C-标记)，其被认为是L-甲硫氨酸(Met)和DMA之间的中间体，并进行了掺入实验。结果，两种化合物均未掺入 DMA 中。这一结果否定了迄今为止预测的生物合成途径的可能性。 2. 为了阐明上述途径，我们决定研究当初始前体 Met 转化为 DMA 时分子中每个原子的变化。使用^ 13 C、^ 15 N、^ 2H标记的Met进行研究的结果是，当Met的第2位的^ 2H转变为DMA时，所有三个分子消失，但其他原子没有消失。直接进入DMA。该结果表明氮杂环丁烷-2-羧酸可能是中间体。基于这一结果，我们提出了一条新的生物合成途径。 3.我们发现DMA生物合成与蛋氨酸循环耦合。 4.为了分离DMA生物合成酶，利用缺铁小麦根制备粗酶。我们尝试以[1-^ 13 C]Met为底物，采用HPLC和MASS相结合的检测方法来测定DMA生物合成酶，但活性较低且无法分离酶。 5.为了分离编码DMA生物合成酶的基因，使用经过铁处理和未经铁处理的小麦根构建了cDNA文库。我们目前正在利用差异杂交进行筛选。