c-Met受容体を介した細胞内情報伝達におけるチロシンリン酸化蛋白質の役割

酪氨酸磷酸化蛋白在 c-Met 受体细胞内信号转导中的作用

基本信息

批准号：
06780591
负责人：
駒田雅之
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、hepatocyte growth factor(HGF)で細胞を刺激した時に分子量約115kDaの蛋白質(p115)が強くチロシン・リン酸化されることを見出している。したがってp115はHGFの細胞内シグナル伝達において何らかの役割を果していると予想される。しかしp115はいくつかの既知のチロシン・リン酸化蛋白質に対する抗体と反応しないことから、新規蛋白質である可能性が考えられた。そこで本研究ではp115の構造と機能を明らかにするために、その精製、およびcDNAクローニングを行った。HGFで刺激したマウス・メラノーマ細胞株B16-F1から、抗ホスホチロシン抗体カラムとプレパラテイブSDS-PAGEの2ステップでp115を精製し、プロテアーゼ処理によって得られた6個のフラグメントのアミノ酸配列を決定した。これらの配列は既知の蛋白質と相同性を有しておらず、p115が新規蛋白質であることが示された。そこでこれらの配列をもとにオリゴヌクレオチド・プライマーを合成し、PCR法でp115cDNAを増幅した。そしてこのPCR産物をプローブとしてマウスのcDNAライブラリーをスクリーニングして完全長のcDNAを得た。このcDNAは775個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしていた。一次構造上の特徴として、タンデムにつながった2個のZnフインガー領域、プロリンに富む領域、そしてプロリンおよびグルタミンに富む領域を有していたが、それ以外に既知のドメイン構造とのホモロジーは見出されなかった。ノーザン・ブロット解析の結果、p115のmRNAは3.0kbであり、調べた限りのすべてのマウスの組織、さらにマウス胎児においても発現していることが明らかとなった。以上の結果から、p115はHGFの細胞内シグナル伝達においてユニークな役割を果たす因子であることが示唆された。

我们发现，当细胞受到肝细胞生长因子 (HGF) 刺激时，分子量约为 115 kDa 的蛋白质 (p115) 会被强烈酪氨酸磷酸化。因此，p115有望在HGF细胞内信号转导中发挥一定作用。然而，p115 不与针对几种已知酪氨酸磷酸化蛋白的抗体发生反应，这表明它可能是一种新蛋白。因此，本研究为了明确p115的结构和功能，对其进行纯化并进行cDNA克隆。使用抗磷酸酪氨酸抗体柱和制备型SDS-PAGE从HGF刺激的小鼠黑色素瘤细胞系B16-F1中纯化p115，并测定通过蛋白酶处理获得的6个片段的氨基酸序列。这些序列与已知蛋白质没有同源性，表明p115是一种新蛋白质。因此，根据这些序列合成寡核苷酸引物，并通过PCR扩增p115 cDNA。使用该PCR产物作为探针，他们筛选了小鼠cDNA文库并获得了全长cDNA。该 cDNA 编码由 775 个氨基酸组成的蛋白质。其主要结构特征包括两个串联连接的锌指区域、富含脯氨酸的区域以及富含脯氨酸和谷氨酰胺的区域，但尚未发现与已知结构域结构的其他同源性。 Northern 印迹分析显示 p115 mRNA 大小为 3.0 kb，在所有检查的小鼠组织以及小鼠胎儿中表达。这些结果表明p115是在HGF细胞内信号转导中发挥独特作用的因子。