神経細胞の軸索起始部とランビエ節への電位依存性Naチャネル局在化機構

电压门控Na通道定位于神经元轴突起点和Ranvier节点的机制

基本信息

批准号：
15016043
负责人：
駒田雅之
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

βIV-スペクトリン・アイソフォームΣ6の機能βIV-スペクトリンの全長型アイソフォームΣ1と、N末端側の約半分の領域を欠くアイソフォームΣ6の各々の機能を解明するため、Σ1の発現のみをノックアウトしたマウスを作製した。脳ライセートを用いたウエスタンブロット解析の結果、このマウスではΣ1の発現がないこと、そしてΣ6の発現は正常であることが確認できた。そこでこのマウスを用いて解析を行い、以下の結果を得た。(1)脳、座骨神経の切片を抗βIV-スペクトリン抗体で免疫蛍光染色した結果、Σ6はΣ1非依存的に軸索起始部とランビエ節に局在できることが明らかとなった。(2)脳、座骨神経の切片を電位依存性NaチャネルおよびアンキリンGに対する抗体で免疫蛍光染色した結果、このマウスでは、以前に解析したΣ1とΣ6をともに欠失したマウスと同様のレベルで軸索起始部とランビエ節におけるNaチャネルとのアンキリンGの局在が低下していた。このことからNaチャネルとのアンキリンGの局在安定化にはΣ1が主要な役割を果たしていることが示唆された。βIV-スペクトリンの可変領域に結合する蛋白質の同定酵母two-hybrid法によりβIV-スペクトリンの可変領域結合蛋白質として同定された14-3-3蛋白質が、哺乳類細胞の中でもβIV-スペクトリンと結合しているかどうかを、マウス脳のおよび両蛋白質を過剰発現させた培養細胞のライセートを用いた共免疫沈降法によって調べた。しかし結合を検出することができなかった。βIV-スペクトリンのランビエ節への膜蛋白輸送における機能14-3-3蛋白質がキネシンとβIV-スペクトリンをつなぐアダプターとして、βIV-スペクトリンとその結合蛋白質の軸索輸送に関与しているか調べるため、初代培養神経細胞にトランスフェクションによりβIV-スペクトリンおよびその変異体を発現させる系を確立した。

β-spectrin同工型σ6的功能阐明了β-spectrin的全长同工型σ1和同工型σ6的功能，该功能仅产生了N末端上的大约一半的小鼠，仅产生了仅敲除σ1表达的小鼠。使用脑裂解物的蛋白质印迹分析证实，该小鼠中没有σ1表达，并且σ6表达是正常的。因此，使用该小鼠进行了分析，并获得了以下结果。（1）用抗βIV-谱蛋白抗体对大脑和坐骨神经的免疫荧光染色表明，σ6可以定位于轴突起源和lambier节点，并以σ1独立的方式定位。（2）在这只小鼠中，具有电压依赖性的Na通道和针对Ankyrin g的电压依赖性Na通道和抗体的坐骨神经的免疫荧光染色表明，在Lambier节点中，轴突起源和Na通道之间的Ankyrin g的定位降低了与两者相似的水平相似的水平。这表明σ1在用Na通道的Ankyrin G局部稳定中起着重要作用。鉴定与β-spectrin的可变区域结合的蛋白质：是否通过使用过度异化的细胞在培养基中培养了培养基蛋白，通过培养基化的细胞来调查YEAST两性杂交方法的14-3-3蛋白，是否通过酵母双杂化方法鉴定为β-spectrid的可变区域结合蛋白，与β-spectrid结合。但是，无法检测到结合。 βIV-光谱蛋白在膜蛋白传递到lambier节点中的运输功能，以研究14-3-3蛋白是否参与β-spectrin的轴突转运及其结合蛋白作为适配器，作为适配器，我们将动力素和β-spectrin连接起来，我们建立了一种由Transfection transfection transfection transfection transfection transfection transfection transfection transfection transfection。