神経細胞の軸索起始部とランビエ節への電位依存性Naチャネル局在化機構

电压门控Na通道定位于神经元轴突起点和Ranvier节点的机制

基本信息

批准号：
15016043
负责人：
駒田雅之
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

βIV-スペクトリン・アイソフォームΣ6の機能βIV-スペクトリンの全長型アイソフォームΣ1と、N末端側の約半分の領域を欠くアイソフォームΣ6の各々の機能を解明するため、Σ1の発現のみをノックアウトしたマウスを作製した。脳ライセートを用いたウエスタンブロット解析の結果、このマウスではΣ1の発現がないこと、そしてΣ6の発現は正常であることが確認できた。そこでこのマウスを用いて解析を行い、以下の結果を得た。(1)脳、座骨神経の切片を抗βIV-スペクトリン抗体で免疫蛍光染色した結果、Σ6はΣ1非依存的に軸索起始部とランビエ節に局在できることが明らかとなった。(2)脳、座骨神経の切片を電位依存性NaチャネルおよびアンキリンGに対する抗体で免疫蛍光染色した結果、このマウスでは、以前に解析したΣ1とΣ6をともに欠失したマウスと同様のレベルで軸索起始部とランビエ節におけるNaチャネルとのアンキリンGの局在が低下していた。このことからNaチャネルとのアンキリンGの局在安定化にはΣ1が主要な役割を果たしていることが示唆された。βIV-スペクトリンの可変領域に結合する蛋白質の同定酵母two-hybrid法によりβIV-スペクトリンの可変領域結合蛋白質として同定された14-3-3蛋白質が、哺乳類細胞の中でもβIV-スペクトリンと結合しているかどうかを、マウス脳のおよび両蛋白質を過剰発現させた培養細胞のライセートを用いた共免疫沈降法によって調べた。しかし結合を検出することができなかった。βIV-スペクトリンのランビエ節への膜蛋白輸送における機能14-3-3蛋白質がキネシンとβIV-スペクトリンをつなぐアダプターとして、βIV-スペクトリンとその結合蛋白質の軸索輸送に関与しているか調べるため、初代培養神経細胞にトランスフェクションによりβIV-スペクトリンおよびその変異体を発現させる系を確立した。

βIV-血影蛋白亚型Σ6的功能为了阐明βIV-血影蛋白全长亚型Σ1和亚型Σ6（缺少大约一半的N末端区域）的功能，仅敲除Σ1的表达小鼠。使用脑裂解物进行的蛋白质印迹分析证实，该小鼠不表达Σ1，而Σ6表达正常。因此，我们使用该小鼠进行了分析并获得了以下结果。 (1)用抗βIV-血影蛋白抗体对脑和坐骨神经切片进行免疫荧光染色，结果表明Σ6可以以不依赖Σ1的方式定位于轴突起点和Ranvier节点。 (2) 用抗电压门控 Na 通道和锚蛋白 G 的抗体对脑和坐骨神经切片进行免疫荧光染色，结果显示该小鼠显示出与先前分析的缺乏锚蛋白 G 定位的 Σ1 和 Σ6 小鼠相似的轴损耗水平。脊髓起点和 Ranvier 结处的 Na 通道减少。这表明 Σ1 在稳定锚蛋白 G 与 Na 通道的定位方面发挥着重要作用。与βIV-血影蛋白可变区结合的蛋白质的鉴定通过酵母双杂交法鉴定为βIV-血影蛋白可变区结合蛋白质的14-3-3蛋白质在中与βIV-血影蛋白结合。这是通过使用小鼠脑裂解物和过表达两种蛋白质的培养细胞裂解物进行免疫共沉淀来研究的。然而，没有检测到结合。 βIV-血影蛋白在膜蛋白转运至Ranvier结中的功能为了检查14-3-3蛋白是否作为连接驱动蛋白和βIV-血影蛋白的接头参与βIV-血影蛋白及其结合蛋白的轴突转运。 βIV-血影蛋白及其突变体通过转染到原代培养的神经元中表达的系统。