Lys63結合型ポリユビキチン鎖を検出する分子プローブの開発とその応用

Lys63连接的多聚泛素链分子探针的开发及其应用

基本信息

批准号：
21657031
负责人：
駒田雅之
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

脱ユビキチン(Ub)化酵素AMSHは、Lys63結合型ポリUb鎖を選択的に切断する酵素である。我々はこれまでに、AMSHの触媒ドメインの酵素活性欠失変異体がLys63結合型Ub鎖と安定な複合体を形成することを具出している。本研究では、酵素活性を欠失させたAMSHの触媒ドメインをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として大腸菌に発現させ、グルタチオン・ビーズを用いて精製した。そして、このGST融合タンパク質をLys63結合型Ub鎖を特異的に認識する分子プローブとして利用することができないか、以下の2つの実験により検討した。1.固定しpermeabilizeしたHeLa細胞をAMSH-GST融合タンパク質とインキュベートし、細胞内のLys63結合型Ub化されたタンパク質と結合させた。未結合のGST融合タンパク質を除いた後、抗GST抗体による免疫染色でLys63結合型Ub化された細胞内タンパク質の局在の同定を試みた。しかし、コントロール細胞と比べて強く染色される細胞内部位を見出すことはできなかった。用いるGST融合タンパク質の濃度やインキュベーションの温度、時間などの条件を細かく検討する必要が示唆された。2.精製したAMSH-GST融合タンパク質をグルタチオン・ビーズにコンジュゲートし、HeLa細胞のライセートを加えてインキュベートした。ビースを洗浄後、結合タンパク質をSDSで溶出し、電気泳動後、抗Ub抗体でイムノブロッティングした。その結果、Ub化タンパク質のスメアーが検出された。このスメアーは、コントロールのGSTタンパク質によってはプルダウンされなかった。AMSH触媒ドメインはLys63結合型Ub鎖に特異的に結合することから、このドメインがHeLa細胞中でLys63結合型Ub化されたタンパク質をプルダウンできることが示唆された。引き続き、この系をスケールアップして大量のLys63結合型Ub化タンパク質を調製し、プロテオーム解析によりそれらの網羅的同定を試みたい。

去泛素化 (Ub) 酶 AMSH 是一种选择性裂解 Lys63 连接的多聚 Ub 链的酶。我们之前已经证明，AMSH 催化结构域中缺乏酶活性的突变体与 Lys63 结合的 Ub 链形成稳定的复合物。在本研究中，缺乏酶活性的 AMSH 催化结构域在大肠杆菌中表达为与谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 的融合蛋白，并使用谷胱甘肽珠进行纯化。进行了以下两个实验来检验该GST融合蛋白是否可以用作特异性识别Lys63结合的Ub链的分子探针。 1. 将固定且透化的 HeLa 细胞与 AMSH-GST 融合蛋白一起孵育，该融合蛋白与细胞内 Lys63 缀合的 Ub 缀合蛋白结合。去除未结合的 GST 融合蛋白后，我们尝试通过抗 GST 抗体免疫染色来鉴定 Lys63 缀合的 Ub 缀合的细胞内蛋白的定位。然而，不可能找到任何与对照细胞相比染色更强烈的细胞内位点。这表明有必要仔细考虑使用的GST融合蛋白的浓度以及孵育的温度和时间等条件。 2. 将纯化的 AMSH-GST 融合蛋白与谷胱甘肽珠缀合，并与 HeLa 细胞裂解液一起孵育。洗涤珠子后，用 SDS 洗脱结合的蛋白质，进行电泳，然后用抗 Ub 抗体进行免疫印迹。结果，检测到了Ub结合蛋白的涂片。该涂片没有被对照 GST 蛋白拉下来。 AMSH 催化结构域特异性结合 Lys63 连接的 Ub 链，表明该结构域可以在 HeLa 细胞中下拉 Lys63 连接的 Ub 缀合蛋白。接下来，我们希望扩大该系统的规模，制备大量Lys63结合的Ub缀合蛋白，并尝试通过蛋白质组分析对其进行全面鉴定。