植物の光受容蛋白質フィトクロム及びその発色団ドメインの結晶化と構造解析

植物光感受器蛋白光敏色素及其发色团结构域的结晶和结构分析

• 批准号: 06780527
• 负责人: 中迫 雅由
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780527/
• 关键词: 結晶化; フォトクロム; 光形態形成

本申請では、植物の光受容蛋白質であるA型フィトクロムの結晶化を主たる目標として研究を遂行した。試料には、純度の高い標品を得ることのできるアラスカエンドウA型フィトクロムを使用した。このA型フィトクロムは分子量114kDaのポリペプチドの二量体として存在する。今回の結晶化では、その二量体と二量体をトリプシン分解して得られる発色団ドメイン(分子量59kDa)を使用した。まず、いずれの試料についても300種類の結晶化用沈殿剤溶液を準備し、ハンギングドロップ蒸気拡散法により、初期的な結晶化条件の探索を行った。A型フィトクロムは、生体内での存在量が非常に少ないてめ、ハンギングドロップには0.7μlのA型フィトクロム溶液を使用し、少ない試料でより多くの条件探索を行うことを心がけた。1)発色団ドメインの結晶化発色団ドメインは二量体のトリプシン処理によって得られるが、極微小量のトリプシンが処理後混在しており、1ヵ月以上を要する結晶化条件探索の期間中に発色団ドメインが更に分解されることが判明した。現在、トリプシンの標品からの完全な除去方法を検討中である。2)二量体の結晶化結晶化条件探索の結果、A型フィトクロム二量体は臨界ミセル濃度以下の界面活性剤やグリセリン存在下で結晶化が可能であることが判明した。沈殿剤には、ポリエチレングリコール、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムが有効であり、pHは7以上であることが不可欠であった。いずれの場合にも、得られる結晶は25μm程度の太さの棒状結晶であるため、実験室でのX線回折実験では、結晶の空間群を同定できるほどの回折斑点が十分に観察されていない。今後は、結晶学的研究に耐えうる結晶成長条件を探索する予定である。

在此应用中，进行了研究，其主要目标是A型植物色素（即植物的光结合物）进行结晶。作为样本，我使用了alas ka -e -e -e -e -e -e -e -e -e -type植物色素，可以获得高纯度标记。这种类型的A植物色素作为一种双度多肽存在，分子量为114 kDa。在这种结晶中，通过分解配音和双体以分解身体而获得的着色团队域（分子量59KDA）。首先，为每个样品准备了300种结晶的沉积溶液，并通过悬挂液滴蒸汽扩散法搜索初始结晶条件。 A型植物色素在活体中的存在非常低，并且一直试图使用0.7μlA型-A型植物色素溶液进行悬挂滴剂，以探索更多样品的条件。 1）着色团队的结晶颜色团队域是通过称为胰蛋白酶处理获得的，但是在处理后混合了少量的胰蛋白酶，并且需要一个月以上的时间才能搜索结晶条件。组域进一步分解。我们目前正在考虑从胰蛋白酶标记中使用完整的去除方法。 2）由于搜索双体的结晶结晶条件，发现A型A型植物双体可以在临界胶束浓度或更低的表面活性剂或甘油中结晶。聚乙二醇，磷酸铵和硫酸铵对于沉淀剂有效，至关重要的是具有7个或更多的pHS。无论如何，所获得的晶体是厚度约为25μm的杆晶体，因此在实验室的X射线衍射实验中，没有足够的斑点来识别晶体空间。将来，我们计划探索可以承受晶体研究的晶体生长条件。