低温下における蛋白質X線結晶構造解析による蛋白質熱振動の研究

利用蛋白质低温X射线晶体结构分析研究蛋白质热振动

基本信息

批准号：
07280230
负责人：
中迫雅由
金额：
$ 0.7万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07280230/
关键词：
低温蛋白質X線結晶構造解析蛋白質熱振動蛋白質物性

项目摘要

本研究課題では、低温下での蛋白質振動の熱的挙動を詳細に研究するための技術開発とその初期的な応用を行った。低温下での蛋白質X線結晶構造解析技術の確立蛋白質結晶のX線露光時の放射線損傷を低減させ、低温下での蛋白質の熱振動挙動研究のために、蛋白質結晶を100K程度の低温に急速冷却し回折強度測定を行うための技術検討を行った。特に、結晶の急速冷却のために100μm程度の厚みにスライスしたキャピラリーを結晶マウント具として用いる方法を開発した。国内では、低温実験がまだ未発達であり、その普及のために、本研究で確立された低温実験における一連の方法論や過程の詳細についてまとめた小冊子(Nakasako, "Methods in cryogenic protein crystallography")を作成し配布した。今回開発された方法は、実験室ならびに放射光実験施設において実際に適用され、低温下でのX線回折実験の有効性が確認された。トリプシン、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素、放射線損傷に対して脆弱なH2プロテアーゼ、ニトリルヒドラターゼ結晶の回折強度測定に適用された。トリプシンの低温下X線回折実験蛋白質の低温物性をX線結晶構造解析の立場から探索して行くために、典型的な酵素であるトリプシンに着目して低温下X線回折実験を開始した。今後の研究の基礎データを確立すべく、3種類(斜方晶系2種類、三方晶系1種類)の結晶について低温下(100K)および室温下での回折実験および構造精密化を行い、蛋白質構造の温度変化、低温下での水和水のネットワーク構造を解析した。特に、蛋白質を取り囲む水分子の水素結合ネットワークには水分子を100以上含むものであり、蛋白質の熱振動に大きな影響を及ぼしていることが推察された。構造精密化後の水分子の配置解析のために、専用のプログラム開発(FESTKOP)も行った。耐熱性および改変イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の低温結晶構造解析イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性は複数種のキメラおよび点突然変異酵素を用いて議論されてきたが、幾つかの改変酵素についてはその熱安定性を十分に説明できないでいる。本研究では、まず、改変酵素の水和構造の差異がその熱安定性に如何に関わるかを検討するために耐熱性とその改変型の低温構造解析を行ってた。野性型については、通常の蛋白質と同じく低温下でガラス転移点を持つことが示唆された。また、改変酵素(2T2M6T_S82R)は構造が揺らぎやすいことが示された。

在这项研究中，我们开发了技术开发及其最初的应用，以详细研究低温下蛋白质振动的热行为。在低温下建立的蛋白质X-射线晶体结构分析技术在X -RAR的蛋白质晶体暴露期间降低辐射损伤，并研究低温下蛋白质的热振动行为，迅速快速的蛋白质晶体至约100K进行测量折叠的强度和强度测量。特别是，我们开发了一种将毛细管切成约100μm的毛细管作为晶体安装的方法，以晶体的快速冷却。在日本，低温实验仍然不发达，为了扩散它，一本小册子（Nakasako，“低温蛋白质晶体学中的方法”）总结了本研究中建立和分布的一系列方法和一系列方法。这次开发的方法实际上应用于实验室和辐射光学实验设施，并确认了在低温下X射线衍射实验的有效性。它被应用于易受攻击的H2蛋白酶和容易受到胰蛋白酶，异丙基酸氢酶和辐射损伤的硝基甲性氢蛋白酶晶体。为了探索胰蛋白酶低温度x-射线对话的低温度对象，从x-射线晶体结构分析开始启动蛋白质的低温度对象，然后开始了低 - 温度x -ray衍射实验专注于典型的酶胰蛋白酶。为了建立未来研究的基本数据，已经在低温（100K）和室温下进行了三种类型的晶体（两种类型的倾斜晶体，一种三面晶体），并进行了蛋白质。分析了在低温下的水合水的结构和网络结构。特别是，假定蛋白质周围的氢分子的氢结合网络包含100多个水分子，这对蛋白质的热振动具有显着影响。为了在结构精度后的水分子排列，还进行了专用的程序开发（Festkop）。已经使用多种类型的嵌合体和低温晶体晶体晶体结构分析的专用嵌合体进行了抗性和改良的异丙基酸酶，但是对于某些改良的酶，它无法完全解释其热稳定性。在这项研究中，进行了耐热性和改良的低温度结构分析，以检查改性酶的水合结构与其热稳定性如何相关。有人提出，野生型类型具有玻璃转移点，例如正常蛋白。此外，还表明修饰酶（2T2M6T_S82R）的结构很容易波动。