神経組織に特異的に発現するミオシンの機能とその発現機構の解明

阐明神经组织特异性表达的肌球蛋白的功能和表达机制

基本信息

批准号：
06780492
负责人：
高橋正行
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780492/
关键词：
ミオシン非筋細胞神経組織組織特異的発現

项目摘要

非筋細胞ミオシン重鎖のアイソフォームであるMHC-Bのアクチン結合部位に神経組織特異的に発現しているB1インサーションの機能及びその発現機構を明らかにすることを目的として今年度は以下の研究を行った。(1)インサーション部分に相当する12merのペプチドを合成し、それに対するポリクローナル抗体を免疫ウサギから調製した。以下はこの抗体を用いた実験結果である。(a)小脳組織でのB1の発現部位を特定するために、小脳の凍結切片を用いてイムノヒストケミストリーを行った。MHC-Bアイソフォームのすべてのサブタイプを認識する抗体を用いて蛍光抗体染色をしたところ、プルキンエ細胞層と分子層が染色された。B1に対する抗体を用いた場合、プルキンエ細胞層が特に染色された。この結果は、MHC-B(B1)がプルキンエ細胞の細胞体に特に発現していることを示唆する。(b)前年度の研究で神経成長因子によって分化誘導されたPC12細胞においては、MHC-B(B1)は発現しないことがわかった。そこで、今年度は、ラット小脳の神経細胞の初代培養系を試み、試行錯誤の結果、ようやく好ましい培養条件を確立できた。この初代培養系を蛍光抗体染色したところ、B、B1の抗体共にプルキンエ細胞と思われる非常に大きな細胞の細胞体を特異的に染色した。現在この細胞が本当にプルキンエ細胞であるかどうか検討中である。(2)B1インサーション配列が、脳を持つ生物に普遍的に存在するかどうかを検討するために、まずは、MHC-BのでcDNA配列が決定されているアフリカツメガエルと、抗体によってB1の存在が確認されているラットの脳からto talRNAを調製し、PT-PCR法を用いて調べた。その結果、ラットのB1インサーションの配列はヒトと完全に一致した。ところが、アフリカツメガエルからはRT-PCRプロダクトは得られず、B1が存在していないと考えられる。現時点でB1の存在が確認されている生物は鳥類とほ乳類に限られており、両生類には存在しないことから、B1インサーションは進化上において鳥類とほ乳類との分岐点である初期爬虫類で発現し始めたのではないかと考えられる。

为了阐明B1插入的功能和表达机制，B1插入在神经组织中MHC-B（非肌肉细胞肌球蛋白重链的亚型）的肌动蛋白结合位点特异性表达，我们将进行以下研究。进行了研究。 (1)合成对应于插入部分的12mer肽，并从免疫兔中制备针对它的多克隆抗体。以下是使用该抗体的实验结果。 (a) 为了确定小脑组织中 B1 的表达位点，使用小脑冷冻切片进行免疫组织化学分析。使用识别 MHC-B 同工型所有亚型的抗体进行荧光抗体染色，对浦肯野细胞和分子层进行染色。当使用针对 B1 的抗体时，浦肯野细胞层被特别染色。该结果表明MHC-B(B1)在浦肯野细胞的细胞体中特异性表达。 (b)前一年的研究发现，神经生长因子诱导分化的PC12细胞中不表达MHC-B(B1)。因此，今年我们尝试了大鼠小脑神经元的原代培养体系，经过多次尝试，终于建立了良好的培养条件。当该原代培养系统用荧光抗体染色时，抗体 B 和 B1 都特异性地对看似浦肯野细胞的非常大的细胞的细胞体进行染色。我们目前正在研究这些细胞是否真的是浦肯野细胞。 (2)为了检验B1插入序列是否普遍存在于有脑的生物体中，我们首先检测了非洲爪蟾的MHC-B cDNA序列，并使用抗体从证实的大鼠中制备了B1的存在。大脑并使用 PT-PCR 方法进行检查。结果，大鼠B1插入序列与人类完全匹配。然而，没有从爪蟾中获得RT-PCR产物，表明B1不存在。目前，B1的存在仅在鸟类和哺乳动物中得到证实，而在两栖动物中并不存在，因此B1的插入很可能在早期爬行动物中表达，这是鸟类和哺乳动物之间的进化分歧点。认为它可能已经开始了。