非ペプシン型カルボキシルプロテアーゼ活性中心の検索と構造機能相関

寻找非胃蛋白酶羧基蛋白酶活性中心及构效关系

基本信息

批准号：
06780479
负责人：
井上英史
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

結果1. Aspergillus niger var.macrosporusが分泌する非ペプシン型酸性プロテアーゼであるプロクターゼAの活性中心残基を検索するために化学修飾を行った。プロクターゼAはpH6以上で不可逆的に失活するので用いることのできる反応は限定される。本研究ではカルボキシル基、トリプトファン、ヒスチジンに対する化学修飾を行った。その結果、カルボキシル基の収縮により活性の低下が見られ、トリプトファンやヒスチジンは修飾されなかった。結果2. アスパラギン酸残基・グルタミン酸残基を標的に部位特異的変異を行った。プロクターゼAはScytalidium lignicolumのプロテアーゼBとアミノ酸配列が50%一致することから、活性中心は両者の間で保存されていると考えられる。そこで保存されている16個のアスパラギン酸及びグルタミン酸残基をそれぞれアスパラギンまたはグルタミンに変換した変異体を作製し、活性を測定した。その結果、Asp123とAsp220を変異した場合のみに活性が消失した。結論この2つの残基は近傍に分子内ジスルフィド結合が存在することから、高次構造上で近くに位置すると考えられ、プロクターゼAはペプシン型アスパラギン酸プロテアーゼと同様に2つのアスパラギン酸残基が活性中心を形成していると考えられる。プロクターゼAはペプシン型アスパラギン酸プロテアーゼと一次構造の共通性が全く見られないことから、収斂進化により触媒機構の類似した2つのアスパラギン酸ファミリーが存在すると予想される。

结果1。进行化学修饰，以搜索Proctase A的活性中心残基，Aspergillus Niger Var分泌的非胃蛋白型酸性蛋白酶。大孢子。在pH 6或更高的情况下，原生酸A被不可逆地停用，因此可以使用的反应受到限制。在这项研究中，对羧基，色氨酸和组氨酸进行了化学修饰。结果，由于羧基收缩而降低了活性，色氨酸和组氨酸未经修饰。结果2。对天冬氨酸残基和谷氨酸残基的靶标进行了定向突变。 Proctase A与Scytalidium Lignicolum的蛋白酶B的氨基酸序列一致，因此人们认为活性中心是在它们之间保守的。在那里准备了突变体，其中分别将16种保守的天冬氨酸和谷氨酸残基转化为天冬酰胺或谷氨酰胺，并测量其活性。结果，只有在ASP123和ASP220突变时才丢失活动。结论由于这两个残基附近存在分子内二硫键键，因此人们认为Proctase A位于附近，并且人们认为两个天冬氨酸残基形成了活性中心，类似于胃蛋白酶型黄体蛋白酶。 Proctase A在与胃蛋白酶天冬氨酸蛋白酶的一级结构中没有任何共同点，预计收敛进化将呈现两个具有相似催化机制的天冬氨酸家族。