エピトープ特異性抗ヒトCYP3A抗体の作製とヒトにおける分子多型の解析

表位特异性抗人 CYP3A 抗体的生成和人类分子多态性分析

基本信息

批准号：
06772214
负责人：
宮田昌明
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06772214/
关键词：
CYP3A4 CYP3A5 抗オリゴペプチド抗体分子多型

项目摘要

CYP3A4およびCYP3A5を特異的に識別する抗オリゴペプチド抗体を作製するために、それぞれのアミノ酸配列から特異的配列のペプチドを合成した。BSAに上記のペプチドを結合させ抗原とし常法に従い兎に免疫し、抗体を作製した。一方すでに単離しているCYP3A4およびCYP3A5cDNAをCOS-1細胞にトランスフェクションし、CYP3A4およびCYP3A5を発現したCOS-1細胞を作製し、ミクロゾームを調整した。これらのミクロゾームにCYP3A4およびCYP3A5が発現していることを抗CYP3A2抗体により確認した。これらのミクロゾームを用い、作製した抗ペプチド抗体の特異性等について検討したところ、抗CYP3Aペプチド抗体についてはCYP3A4特異的に反応し、CYP3A5とは反応しないことが示された。一方、抗CYP3A5ペプチド抗体については、特異性は認められなかった。次に抗CYP3A4ペプチド抗体がミクロゾーム中のCYP3A4の活性を阻害することができるかどうか、テストステロン6β-水酸化活性を測定することにより検討したが、活性阻害は認められなかった。抗CYP3A4ペプチド抗体はCYP3A4にのみ特異的に反応することより、ヒト肝におけるCYP3A4の含量を測定したところ有意な個体差が認められ、CYP3A4のタンパクレベルでの多型の存在が示唆された。現在異なる部位のペプチドを合成し、活性を阻害することができる特異抗体の作製を試みている。

为了产生特异性区分CYP3A4和CYP3A5的抗硫代肽抗体，从其各自的氨基酸序列合成了特定序列的肽。上述肽与BSA结合，并根据常规方法对兔子进行免疫，并制备抗体。同时，已经将已经分离的CYP3A4和CYP3A5 cDNA转染到COS-1细胞中，并产生表达CYP3A4和CYP3A5的COS-1细胞，并调整了微粒体。抗CYP3A2抗体证实了CYP3A4和CYP3A5在这些微粒体中的表达。当研究了使用这些微粒体产生的抗肽抗体的特异性时，表明抗CYP3A肽抗体与CYP3A4特别反应，并且与CYP3A5不反应。另一方面，未观察到抗CYP3A5肽抗体的特异性。接下来，通过测量测量睾丸激素6β-羟基化活性，研究了抗CYP3A4肽抗体是否可以抑制CYP3A4在微粒体中的活性，但是观察到活性的抑制作用。由于仅在测量人肝脏中CYP3A4的含量时，抗CYP3A4肽抗体才针对CYP3A4特异性反应，因此观察到显着的个体差异，表明在CYP3A4的蛋白质水平上存在多态性。当前，我们正在尝试创建能够在不同位点合成肽并抑制其活性的特定抗体。