薬物代謝酵素遺伝子の肝特異的活性化機序の解析

药物代谢酶基因肝脏特异性激活机制分析

• 批准号: 05772044
• 负责人: 宮田 昌明
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05772044/
• 关键词: 薬物代謝酵素; 発現調節; 肝臓

2種のステロイド6beta-水酸化酵素遺伝子(P450/6betaA,P450/6betaB)の調節領域の塩基配列を解析したところ、転写開始点より上流約200bpまでの領域は、互いの遺伝子間で非常に高い相同性を示した。この領域の塩基配列をさらに詳しく解析したところ肝特異的発現に関与する転写因子であるhepatocyte nuclear factor-4(HNF-4)のコンセンサス配列に類似の配列が、3箇所認められた。これらの3箇所の配列にタンパク因子が、結合することは、ラット肝核抽出液を用いたDNase I footprinting法により確認された。さらに結合するタンパク因子を同定するためにそれぞれの配列のオリゴヌクレオチドを合成し、gel shift法を実施した。HNF-4のコンセンサス配列のオリゴヌクレオチドを用いた競合阻害実験より_-89bpから_-102bpの配列にのみHNF-4およびHNF-4に類似のタンパク因子が結合することが示唆された。次にこれらの配列がP450/6betaA遺伝子の肝特異的発現に関与するのかどうかを明らかにするため、まずBasicCATベクターにさまざまな長さのP450/6betaA遺伝子のプロモーター領域を組み込んだベクターを構築しCATassayを実施した。ヒト肝由来のHepG2cellおよびマウス副腎由来のY1cellを用いたところ、Y1cellはすべてのベクターでほとんど活性の変動は認められなかったが、HepG2 cellを用いた場合_-110bpまでの領域を組み込むことで_-80bpまでの領域を組み込んだベクターに比べ約10倍のCAT活性の上昇が認められた。さらにHNF-4結合領域(_-89bpから_-102bp)の2塩基に変異を導入しタンパク因子の結合を妨げるとCAT活性が低下することも明らかとなった。ヘテロのプロモーターを用いた系においても同様な結果が得られた。以上の結果よりP450/6betaA遺伝子の_-89bpから_-102bpに存在するHNF-4結合配列は、こ遺伝子の肝特異的発現に何らかの役割を果している可能性が示唆された。

当分析了两种类固醇6Beta-羟化酶基因（P450/6BetaA，P450/6Betab）的调节区域的核苷酸序列时，转录起始点上游的区域显示出彼此基因之间的同性恋很高。当进一步分析该区域的核苷酸序列时，发现三个序列与肝细胞核因子-4（HNF-4）的共有序列相似，这是参与肝特异性表达的转录因子。使用大鼠肝核提取物通过DNase I足迹来证实蛋白质因子与这三个序列的结合。另外，将每个序列的寡核苷酸合成以鉴定结合蛋白因子并进行凝胶移位。使用HNF-4共有序列的寡核苷酸的竞争抑制实验表明，相似的蛋白质因子与HNF-4和HNF-4仅与_-89 bp和_-102 bp之间的序列结合。接下来，为了确定这些序列是否参与P450/6BETAA基因的肝特异性表达，首先在基本猫载体中构造了载体，该载体构建了构建了各种长度和CATASSAY的P450/6BETAA基因的启动子区域。当使用人肝脏的HEPG2CELL和小鼠肾上腺的Y1CELL时，所有矢量的活性变化很小，但是当使用HEPG2细胞时，通过将高达_-11-1110 bp的区域增加到cat活性增加了大约10倍的cat活性增加了大约10倍的矢量与将矢量增加了10倍，使其增加了10次。此外，还揭示了将突变引入HNF-4结合区域（_-89bp to_-102bp）中的两个碱基，并抑制蛋白质因子结合可以减少CAT活性。在使用杂型动物的系统中获得了类似的结果。以上结果表明，_-89bp和_-102bp之间的P450/6BetAA基因中存在的HNF-4结合序列可能在该基因的肝特异性表达中起作用。