薬物代謝酵素遺伝子の肝特異的活性化機序の解析

药物代谢酶基因肝脏特异性激活机制分析

• 批准号: 05772044
• 负责人: 宮田 昌明
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05772044/
• 关键词: 薬物代謝酵素; 発現調節; 肝臓

2種のステロイド6beta-水酸化酵素遺伝子(P450/6betaA,P450/6betaB)の調節領域の塩基配列を解析したところ、転写開始点より上流約200bpまでの領域は、互いの遺伝子間で非常に高い相同性を示した。この領域の塩基配列をさらに詳しく解析したところ肝特異的発現に関与する転写因子であるhepatocyte nuclear factor-4(HNF-4)のコンセンサス配列に類似の配列が、3箇所認められた。これらの3箇所の配列にタンパク因子が、結合することは、ラット肝核抽出液を用いたDNase I footprinting法により確認された。さらに結合するタンパク因子を同定するためにそれぞれの配列のオリゴヌクレオチドを合成し、gel shift法を実施した。HNF-4のコンセンサス配列のオリゴヌクレオチドを用いた競合阻害実験より_-89bpから_-102bpの配列にのみHNF-4およびHNF-4に類似のタンパク因子が結合することが示唆された。次にこれらの配列がP450/6betaA遺伝子の肝特異的発現に関与するのかどうかを明らかにするため、まずBasicCATベクターにさまざまな長さのP450/6betaA遺伝子のプロモーター領域を組み込んだベクターを構築しCATassayを実施した。ヒト肝由来のHepG2cellおよびマウス副腎由来のY1cellを用いたところ、Y1cellはすべてのベクターでほとんど活性の変動は認められなかったが、HepG2 cellを用いた場合_-110bpまでの領域を組み込むことで_-80bpまでの領域を組み込んだベクターに比べ約10倍のCAT活性の上昇が認められた。さらにHNF-4結合領域(_-89bpから_-102bp)の2塩基に変異を導入しタンパク因子の結合を妨げるとCAT活性が低下することも明らかとなった。ヘテロのプロモーターを用いた系においても同様な結果が得られた。以上の結果よりP450/6betaA遺伝子の_-89bpから_-102bpに存在するHNF-4結合配列は、こ遺伝子の肝特異的発現に何らかの役割を果している可能性が示唆された。

当分析了两种类型类固醇6Beta-羟化基因（P450/6Betaa，P450/6Betab）的调节面积的基本序列时，在彼此的基因中，该区域高于传递起始点的面积高约200 bp。显示同源。当对该区域的基本序列进行详细分析时，有三个位置与肝细胞核因子-4（HNF-4）的共有序列相似，这是参与肝特异性表达的转录因子。使用大鼠核心提取物的DNase I足迹方法证实了蛋白质因子与这三个位置的结合。为了鉴定结合蛋白因子，合成了每个阵列的寡核苷酸并实现了凝胶移位方法。从竞争抑制性实验中，使用HNF-4共有序列中的寡核苷酸实验，建议仅在_-89BP阵列中与_-89bp阵列中的HNF-4和HNF-4结合。接下来，为了阐明这些阵列是否参与P450/6Betaa基因的肝脏特异性表达，Basiccat Vector首先实现了一个载体，该载体构建了一个载体。使用来自人肝脏的HEPG2细胞和来自小鼠肾上腺的Y1细胞，Y1CELL几乎是所有矢量，几乎没有波动，但是当使用HEPG2细胞时，它是通过将面积纳入_-1110bp _的。与掺入-80 bp的矢量相比，观察到约10倍。此外，据揭示，如果在HNF-4结合区域的2碱基（_-89bp至_-102bp）中引入突变并阻碍蛋白质因子的结合，则CAT活性将减少。使用异性启动子在系统中获得了类似的结果。从上述结果中，提出，_-102bp中P450/6BetAA基因的_-89bp的HNF-4结合序列可能在该基因的肝特异性表达中起作用。