イネ種子アリューロン細胞を用いた細胞特異的cDNAライブラリーの構築

利用水稻种子糊粉细胞构建细胞特异性cDNA文库

基本信息

批准号：
05760079
负责人：
増村威宏
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kyoto Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760079/
关键词：
rice oryza sativa L.aleurone layer cDNA library glutaredoxin thioltransferase seed development tissue specific expression

项目摘要

水稲「日本晴」の登熟期種子三分の一粒を実体顕微鏡下で解体し、アリューロン層とデンプン性胚乳組織に分離した。それぞれの組織より細胞を回収し、全RNAを単離し、oligo(dT)の結合した粒子を用いて微量mRNAを精製した。mRNAよりoligo(dT) primerを用いてcDNAを合成し、末端にdG-tailを付加した後、制限酵素切断部位を末端に導入可能にデザインしたoligo(dT),oligo(dC)・primerを使用し、PCR法によってcDNAを増幅した。cDNAの末端を処理し、アダプターを連結し、大腸菌plasmidに組み込み、形質転換し、cDNAライブラリーを構築した。およそ1,000個の細胞から100万のcDNAクローンを含むライブラリーを作製できた。そのうち、アリューロン細胞特異的cDNAライブラリーより300bp以上の挿入配列を持つクローンをランダムに13クローン選び、ノーザンブロット法によってアリューロン細胞特異的に発現するクローンを選択し、塩基配列決定を行ったところ6種のクローンに分類できた。データバンクによるホモロジー検索の結果、その中の1つのクローン(RASC8)の推定アミノ酸配列が、大腸菌、酵母、ウシ、ブタ等で既に報告されている酸化還元酵素Glutaredoxinと非常に高い相同性を示した。このcDNAを大腸菌で発現させ酵素活性を測定したところ、Glutaredoxinであることが確認できた。Glutaredoxinが植物においても存在することを初めて示すことが出来た。イネGlutaredoxinは、登熟過程種子のアリューロン層に特異的に発現しており、デンプン性胚乳組織、葉および根では発現していない。このことからアリューロン組織に特異的な機能を持つ可能性がある。また、それ以外にライブラリー中での存在割合の高いcDNAもクローン化出来た。ここで構築した組織特異的cDNAライブラリーを用いることにより、本研究課題で目的としていた組織特異的に発現する遺伝子の単離、解析を非常に効率良く行えることが判った。

在立体显微镜下解剖了三分之一成熟的水稻“日本晴”种子，并将其分离成糊粉层和淀粉胚乳组织。从每个组织中收集细胞，分离总 RNA，并使用寡聚 (dT) 结合颗粒纯化痕量 mRNA。使用oligo(dT)引物从mRNA合成cDNA，在末端添加dG尾，然后使用设计为在末端引入限制性酶切位点的oligo(dT)、oligo(dC)引物，然后通过PCR扩增cDNA。方法。处理cDNA末端，连接接头，将cDNA插入大肠杆菌质粒并转化，构建cDNA文库。他们能够创建一个包含来自大约 1,000 个细胞的 100 万个 cDNA 克隆的文库。其中，从糊粉细胞特异性cDNA文库中随机选出13个插入序列在300 bp以上的克隆，通过Northern blotting筛选出在糊粉细胞中特异性表达的克隆，并测定核苷酸序列，得到6种类型。它被归类为克隆体。使用数据库进行同源性搜索的结果是，其中一个克隆（RASC8）的推导氨基酸序列与谷氧还蛋白（一种已在大肠杆菌、酵母、牛、猪等中报道过的氧化还原酶）显示出极高的同源性。 .当该cDNA在大肠杆菌中表达并测量酶活性时，证实它是谷氧还蛋白。我们首次证明谷氧还蛋白也存在于植物中。水稻谷氧还蛋白在成熟种子的糊粉层中特异性表达，在淀粉胚乳组织、叶或根中不表达。这表明糊粉组织可能具有特定的功能。此外，我们还能够在文库中克隆高丰度的 cDNA。通过使用这里构建的组织特异性cDNA文库，发现可以非常有效地进行组织特异性表达基因的分离和分析，这也是本研究项目的目标。