瞬間凍結・マイクロダイセクション法を用いた-細胞からの遺伝子単離への挑戦

使用快速冷冻和显微切割方法从细胞中分离基因的挑战

基本信息

批准号：
11876027
负责人：
増村威宏
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

植物ゲノム解析研究分野において、機能遺伝子の迅速な単離方法の開発は益々その重要性が増大している。そこで、研究代表者がこれまでに培った遺伝子単離技術を活用し、遺伝子発現が進行中の細胞領域をマイクロダイセクション法で取得後、cDNAライブラリーを作製し、特定の組織でのみ発現する機能遺伝子の取得を目標とした。今年度は、加圧凍結法による試料中のmRNAの安定性の確認と微量組織からのcDNAライブラリー作製を試み、ライブラリー中のcDNAの解析を行った。開花後3日目のイネ種子を瞬間凍結し、コンパウンドで固定後切片化し、レーザーメスにより標的細胞周囲を焼き切り、その後レーザーの焦点を変更し特定領域細胞塊のみを打ち上げ、上部に設置したトラップに回収した。この操作を繰り返し、50細胞塊を集め、フェノール抽出により核酸を回収した。Oligo(dT)マグネットビーズでpoly(A)RNAを精製し、cDNA合成後、恒常的に発現しているイネActin I cDNAをPCR法で増幅し、予想される分子量の位置にバンドを確認した。この実験系でmRNAが分解されることなく抽出されていることが確認出来た。次に、微量組織由来cDNAライブラリーの作製を行った。上記と同様にレーザーメスで調製した100細胞塊よりpoly(A)RNAを抽出し、cDNA合成後、末端にプライマー配列を付加するPCR法によりcDNA断片を増幅した。その後、cDNAをλファージベクターに組み込み、cDNA断片の挿入が確認されたクローンの塩基配列を決定した。葉緑体ゲノム配列由来の配列、既知の遺伝子と相同性を示すクローンが多数認められたが、新規の遺伝子をコードしていると考えられるクローンが15%程度存在した。PCRを介することで、余分なDNAを増幅する欠点はあるが、微量特定細胞由来のcDNAライブラリーを作製することが可能であることが判った。今後は、出発細胞数を更に微量化し、ベクターおよび形質転換技術を高め、最終的には一細胞由来のcDNAライブラリー作製の可能性が広がった。

在植物基因组分析研究领域，功能基因快速分离方法的开发变得越来越重要。因此，主要研究人员利用他迄今为止培育的基因分离技术，通过显微切割获得正在进行基因表达的细胞区域，然后创建一个cDNA文库，以检测仅在特定组织中的基因表达。功能基因。今年，我们尝试使用压力冷冻确认样品中mRNA的稳定性，从少量组织中创建cDNA文库，并对文库中的cDNA进行分析。开花后 3 天的水稻种子被快速冷冻，用化合物固定，切片，并使用激光手术刀烧毁目标细胞周围。然后，改变激光焦点，仅将特定区域中的细胞簇发射到回收了顶部设置的陷阱。重复该操作，收集50个细胞团，通过苯酚提取回收核酸。使用Oligo(dT)磁珠纯化Poly(A) RNA，合成cDNA后，通过PCR扩增组成型表达的水稻Actin I cDNA，并在预期分子量位置确认条带。证实使用该实验系统提取的mRNA没有被降解。接下来，构建少量组织来源的cDNA文库。按照与上述相同的方式，从使用激光手术刀制备的100个细胞簇中提取Poly(A) RNA，合成cDNA后，通过在末端添加引物序列的PCR方法扩增cDNA片段。然后，将cDNA插入到λ噬菌体载体中，测定确认插入了cDNA片段的克隆的碱基序列。尽管许多克隆与叶绿体基因组序列和已知基因的序列具有同源性，但大约 15% 的克隆被认为编码新基因。尽管它有扩增过量DNA的缺点，但人们发现使用PCR可以创建来自特定细胞的少量cDNA文库。未来，我们将进一步减少起始细胞的数量，改进载体和转化技术，最终扩大创建源自单细胞的cDNA文库的可能性。