胚乳インジェクション法を用いたイネ科胚乳組織分化の分子機構の解明

胚乳注射法阐明草胚乳组织分化的分子机制

基本信息

批准号：
18658140
负责人：
増村威宏
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyoto Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

穀類の胚乳形成に関する研究は、胚乳組織における貯蔵物質合成に関わる遺伝子の器官レベルの解析が行われてきた。しかし、胚乳形成を制御する分子機構は未だに明らかにされていない。これまでに、胚乳形成期の種子におけるトランスクリプトーム解析を行い、胚乳分化期に強く発現する遺伝子を多数得た。本研究では、それら候補遺伝子が胚乳分化とどのように関係するのかを明らかにするため、未分化状態の生きた胚乳組織へ「胚乳インジェクション法」を用いて合成RNAを直接導入し、「mRNA過剰」や「RNA干渉」を誘導することで、候補遺伝子の機能解析を行うことを目的として研究を進めた。しかし、合成RNA分子をインジェクションすると胚乳組織が形態異常を示し、3年間で目的を達成するのは困難であると判断した。そこで本年度は、RNAiを誘導する分子を導入した形質転換イネを用いて機能解析を行った。【胚乳組織におけるRNA干渉の誘導】胚乳組織で合成・蓄積する「プロラミシ」を候補遺伝子として、RNA干渉を誘導する分子を設計し、矮性イネ、及び日本晴を用いて遺伝子導入した。その結果、多重遺伝子として存在するプロラミン遺伝子群を抑制し、内在性プロラミン分子種の量を減少させることに成功した。更に、RNAi誘導ベクター上で、外来遺伝子を強発現すると外来性タンパク質を多量に蓄積することが明らかとなった。【分化期特異的遺伝子の発現解析】胚乳分化期である開花後5日目の胚乳組織を用い、アリューロン層となる部位、デンプン性胚乳となる部位の網羅的遺伝子発現解析をイネ44kオリゴマイクロアレイを用いて行った。その結果、それぞれの組織で特異的に発現する貯蔵物質関連遺伝子が、既に胚乳分化期から発現していることが明らかになった。それら遺伝子中には転写制御因子遺伝子が存在したので、RT-PCR法を用いて詳細な発現解析を実施した。

对谷物胚乳形成的研究涉及对胚乳组织中参与储存物质合成的基因进行器官水平分析。然而，控制胚乳形成的分子机制尚未阐明。迄今为止，我们已经对种子胚乳形成阶段的转录组进行了分析，获得了许多在胚乳分化阶段强表达的基因。在本研究中，为了阐明这些候选基因如何与胚乳分化相关，我们使用胚乳注射法将合成RNA直接引入活的、未分化的胚乳组织中，本研究的目的是通过以下方法对候选基因进行功能分析：诱导“”和“RNA干扰”。然而，当注射合成RNA分子后，胚乳组织出现形态异常，确定三年内难以实现目标。因此，今年，我们使用导入了诱导RNAi的分子的转基因水稻进行了功能分析。 [在胚乳组织中诱导RNA干扰] 我们利用在胚乳组织中合成并积累的“prolamici”作为候选基因，设计了诱导RNA干扰的分子，并将该基因导入矮化稻和日本晴中。结果，他们成功地抑制了作为多个基因存在的谷醇溶蛋白基因组，并减少了内源性谷醇溶蛋白分子种类的数量。此外，已经揭示当外源基因在RNAi诱导载体上强烈表达时，大量外源蛋白质积聚。 [分化阶段特异性基因的表达分析] 使用花后第5天即胚乳分化阶段的胚乳组织，对成为糊粉层的区域和成为淀粉质胚乳的区域进行综合基因表达分析，使用我用的是水稻 44k 寡核苷酸微阵列。结果表明，在每个组织中特异性表达的贮藏物质相关基因从胚乳分化阶段就已经表达。由于这些基因中存在转录调节基因，因此使用RT-PCR进行详细的表达分析。