バチルス属の生産するサイクロデキストリン生成酵素に関する蛋白質工学的研究

芽孢杆菌产环糊精酶的蛋白质工程研究

基本信息

批准号：
05760062
负责人：
中村顕
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Bacillus ohbensisのサイクロデキストリン生成酵素(CGTase)遺伝子に対して部位特異的変異を行い、188位のアミノ酸を野生型のTyrから、既に作製したものも含めて、残りの19種類のアミノ酸に置換した変異遺伝子を構築した。変異遺伝子を枯草菌に導入し、各種変異酵素を枯草菌の培養上清より生澱粉吸着法を用いて精製した。変異酵素はいずれも程度の差はあるものの、澱粉分解活性とサイクロデキストリン(CD)合成能を有していた。また生成するCDはいずれの酵素の場合も野生型と同様のbeta-及びgamma-CDであり、alpha-CDの生成は認められなかった。野生型酵素、野生型と同様の性質を示したPhe188変異酵素、及びgamma-CD生産性の向上したTrp188変異酵素について、各CDを分解する反応におけるkinetic parameterを測定したところ、Phe188変異酵素では野生型と比較して大きな差は認められなかったものの、Trp188変異酵素ではgamma-CDに対するKm値が約8倍に上昇している事が観察され、その結果、gamma-CDに対するkcat/Km値が野生型の約1/4に減少していた。Trp188変異酵素は一度生成したgamma-CDを分解する活性が弱くなっており、その結果gamma-CDを蓄積するようになったものと考えられる。176位と252位に位置するPhe残基をTrpあるいはTyrに置換した変異酵素を上記と同様の方法で作製したが、その酵素活性に特に大きな変化は認められなかった。将来は野生型、及びTrp188変異酵素について、その結晶化とX線構造解析を行ない、188位のアミノ酸のCD生成に果たす役割について立体構造の面から解析する事が考えられる。

对位置定向的突变进行了杆菌芽孢杆菌的基因基因（CGTase）基因，并构建了突变的基因，在该基因中，在该基因中，在该基因中，在188位的氨基酸中取代了剩余的19种类型的氨基酸，包括已经从Wild-typypy Tyr中产生的氨基酸。将突变基因引入枯草芽孢杆菌中，并使用原始淀粉吸附方法从枯草芽孢杆菌的培养上清液中纯化各种突变酶。尽管所有突变酶的程度都不同，但它们具有淀粉降解活性和环糊精（CD）合成能力。此外，在任何酶的情况下，产生的CD与野生型相同，并且未观察到α-CD。当在降解野生型酶的相应CD的反应中测量动力学参数时，在与野生型酶相似的特性的PHE188突变酶，TRP188突变酶，尽管有任何有意义的酶，但在该酶中没有显着差异，并且在该酶中均未实现cuney的pH。野生型酶，观察到γ-CD的km值增加了约8次，因此，伽马CD的KCAT/KM值降低至野生型酶的约1/4。 TRP188突变酶产生后具有较弱的活性来降解γ-CD，因此，人们认为γ-CD已积累。一种突变酶，其中位于176和252位置的PHE残基被TRP或TRY取代的突变酶以与上述相同的方式制备，但在酶活性中未观察到显着变化。将来，可以对野生型和TRP188突变酶进行结晶和X射线结构分析，并从三维结构的角度分析氨基酸在第188位CD生成中的作用。