相同組換え遺伝子導入による発癌機構の研究

同源重组基因导入致癌机制研究

基本信息

批准号：
03151018
负责人：
井川洋二
金额：
$ 11.84万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至 1993
项目状态：
已结题

项目摘要

劣性表現を持つ癌抑制遺伝子の機能の検証は細胞が持つ一対の相同染色体の両側において当該遺伝子を欠損させなければならないが、それを可能にしたのが、マウス培養胚幹細胞(ES細胞)における相同組換えである。これにより正常遺伝子を欠損導入遺伝子と取替えることができる。そして、この相同組換え胚細胞由来のマウスの交配により両側の当該遺伝子を欠損させたマウスを得、劣性表現を示す当該遺伝子の機能を探る方法の効率化を検討する。そして、ES細胞における相同組換えを利用して個々に特徴ある発癌に関連する遺伝子、特にがん抑制遺伝子の生物個体における機能を解析することを目的としたものである。まず、キメラ形成能の高いES細胞系の樹立では、井川は、相沢らの協力で、正常3日胚(これまでは4日胚を用いた)からの樹立で、これに成功した。また、城石はMHC領域に高頻度組換えを起こすマウス系B10ーA(R209)のES細胞株ESR209.1を樹立しキメラ形成能を確認した。また、中辻はC57BL/6よりES細胞系を樹立し、その生殖系列キメラ形成能を確認した。また、卵原細胞を体外で培養し、雌マウスに移入し、操作された生殖細胞由来の子孫を得た。ES細胞系における相同組換えの高率化では、井川が、相沢らの協力で、ジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子をネガティブ選択に用いることで成功し、実際に、ES細胞系でp53など3つの遺伝子の欠損導入を果たした。木村は、CーHaーrasに偽遺伝子がないことを確かめ、相同組換え用の同遺伝子を含むDNA断片をクロ-ン化した。高橋は、マウスHox3.5遺伝子を組換え用に構築した。若杉は、山村と共同で、相同組換えで欠損させるマウスNFー1遺伝子を単離した。また、野田(哲)は、マウスにおいてWTー1対応遺伝子を単離し、ES細胞系の同遺伝子に相同組換えで欠損を導入した。

为了验证隐性表达的抑癌基因的功能，需要删除细胞内一对同源染色体两侧的基因，而这是通过在培养的小鼠胚胎干细胞中删除同源基因而实现的。 ES 细胞）。这使得正常基因可以被有缺陷的转基因取代。然后，通过培育这些同源重组胚胎细胞衍生的小鼠，获得两侧相关基因均被删除的小鼠，并研究如何提高探索相关基因功能的方法的效率，该基因表现出隐性。表达。本研究的目的是利用胚胎干细胞中的同源重组来分析个体生物体中与癌发生相关的个体基因，特别是抑癌基因的功能。首先，在Aizawa等人的帮助下，Ikawa成功地从正常3天胚胎（之前使用4天胚胎）建立了具有高嵌合体形成能力的ES细胞系。此外，白石建立了小鼠B10-A（R209）ES细胞系ESR209.1，该细胞在MHC区域进行高频重组，并证实了其形成嵌合体的能力。 Nakatsuji 还从 C57BL/6 建立了 ES 细胞系，并证实了其形成种系嵌合体的能力。他们还在体外培养卵原细胞并将其转移到雌性小鼠体内以获得工程化的生殖细胞衍生的后代。为了提高ES细胞系的同源重组率，Ikawa与Aizawa等人合作，成功地利用白喉毒素A片段基因进行阴性选择，事实上，他成功地提高了同源重组率通过使用白喉毒素A片段基因进行阴性选择，在ES细胞系中实现了缺陷导入。木村确认C-Haras中不存在假基因，并克隆了含有相同基因的DNA片段进行同源重组。 Takahashi构建了小鼠Hox3.5基因进行重组。 Wakasugi 与 Yamamura 合作分离出小鼠 NF-1 基因，该基因可以通过同源重组删除。此外，Tetsu Noda在小鼠体内分离出与WT-1相对应的基因，并通过同源重组将缺失引入到ES细胞系中的相同基因中。