相同組換え遺伝子導入による発癌機構の研究

同源重组基因导入致癌机制研究

基本信息

批准号：
03151018
负责人：
井川洋二
金额：
$ 11.84万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至 1993
项目状态：
已结题

项目摘要

劣性表現を持つ癌抑制遺伝子の機能の検証は細胞が持つ一対の相同染色体の両側において当該遺伝子を欠損させなければならないが、それを可能にしたのが、マウス培養胚幹細胞(ES細胞)における相同組換えである。これにより正常遺伝子を欠損導入遺伝子と取替えることができる。そして、この相同組換え胚細胞由来のマウスの交配により両側の当該遺伝子を欠損させたマウスを得、劣性表現を示す当該遺伝子の機能を探る方法の効率化を検討する。そして、ES細胞における相同組換えを利用して個々に特徴ある発癌に関連する遺伝子、特にがん抑制遺伝子の生物個体における機能を解析することを目的としたものである。まず、キメラ形成能の高いES細胞系の樹立では、井川は、相沢らの協力で、正常3日胚(これまでは4日胚を用いた)からの樹立で、これに成功した。また、城石はMHC領域に高頻度組換えを起こすマウス系B10ーA(R209)のES細胞株ESR209.1を樹立しキメラ形成能を確認した。また、中辻はC57BL/6よりES細胞系を樹立し、その生殖系列キメラ形成能を確認した。また、卵原細胞を体外で培養し、雌マウスに移入し、操作された生殖細胞由来の子孫を得た。ES細胞系における相同組換えの高率化では、井川が、相沢らの協力で、ジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子をネガティブ選択に用いることで成功し、実際に、ES細胞系でp53など3つの遺伝子の欠損導入を果たした。木村は、CーHaーrasに偽遺伝子がないことを確かめ、相同組換え用の同遺伝子を含むDNA断片をクロ-ン化した。高橋は、マウスHox3.5遺伝子を組換え用に構築した。若杉は、山村と共同で、相同組換えで欠損させるマウスNFー1遺伝子を単離した。また、野田(哲)は、マウスにおいてWTー1対応遺伝子を単離し、ES細胞系の同遺伝子に相同組換えで欠損を導入した。

验证具有隐性表达的肿瘤抑制基因的功能需要在细胞持有的一对同源染色体的两侧删除该基因，但这可以通过小鼠培养的胚胎干细胞（ES细胞）中的同源重组（ES细胞）中的同源重组。这使得正常基因可以用缺陷的转基因代替。然后，通过源自同源重组生殖细胞的小鼠，具有基因两侧的小鼠是有缺陷的，并且研究了探索显示隐性表达的基因功能的方法的效率。目的是在ES细胞中使用同源重组来分析单独独特的致癌基因，尤其是癌症抑制基因，尤其是在生物体中的功能。首先，在建立具有较高嵌合体形成能力的ES细胞系时，Igawa从正常的3天胚胎（以前使用4天胚胎）成功地建立了它，并与Aizawa的合作建立了它。此外，Shiroishi还建立了小鼠B10-A（R209）的ES细胞系ESR209.1，该ES R209.1在MHC区域进行了高频重组，并确认其嵌合形成能力。 Nakatsuji还建立了具有C57BL/6的ES细胞系，并确认其形成种系嵌合体的能力。此外，在体外培养了卵子基因细胞并转移到雌性小鼠中，并获得了从工程生殖细胞衍生的后代。为了提高ES细胞系中同源重组的速率，Igawa成功地使用了白喉毒素为片段基因，用于与Aizawa等人的合作进行负选择，实际上，他成功地在ES细胞系中成功地引入了包括p53在内的三个基因。 Kimura证实C-HA-RAS没有假基因，并克隆了包含同源重组基因的DNA片段。高桥构建了小鼠HOX3.5基因进行重组。 Wakasugi与Yamamura合作，分离了由于同源重组不足的小鼠NF-1基因。此外，NODA（TETSU）在小鼠中分离了WT-1兼容基因，并通过同源重组将缺陷引入了ES细胞系的相同基因中。