卵母細胞および発生初期の胚におけるプロテインキナ-ゼC・アイソザイムの証明

卵母细胞和早期胚胎中蛋白激酶 C 同工酶的演示

基本信息

批准号：
01570009
负责人：
山村英樹
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Mie University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.卵母細胞におけるプロテインキナ-ゼC(以下Cキナ-ゼ)・アイソザイムの証明(1)B6C3F_1マウスの一次卵母細胞(細胞全体)および二次卵母細胞(凍結切片)に、Cキナ-ゼ・アイソザイムI型、II型およびIII型にそれぞれ特異的な単クロ-ン抗体MCー1a、MCー2aおよびMCー3aを用いて免疫蛍光光染色を施したところ、MCー2aおよびMCー3aとの反応による蛍光が観察され、MCー1aとのインキュベ-ションによって特異的な蛍光は認められなかった。すなわち、マウスの一次および二次卵母細胞には、Cキナ-ゼ・アイソザイムII型とIII型が存在することがわかった。(2)アフリカツメガエルの二次卵母細胞のホモジェネ-トを10万×gで遠心分離して得た上清について、DEAEセルロ-スカラムクロマトグラフィ-およびSDSーPAGEを経て、上記の3種類の単クロ-ン抗体を用いてイムノブロッティングを行ったところ、いずれの抗体によっても分子量約8万の位置にバンドが出現した。このことから、アフリカツメガエルの二次卵母細胞の可溶性画分には、Cキナ-ゼ・アイソザイムI型、II型およびIII型のすべてが存在することが明らかとなった。2.着床前のマウス胚におけるCキナ-ゼ・アイソザイムの証明B6C3F_1マウスの1、2、4細胞期胚(凍結切片)および胚盤胞(胚全体)に、MCー1a、MCー2aおよびMCー3aを用いて免疫蛍光染色を施したところ、すべてのステ-ジの胚で、MCー2aおよびMCー3aとの反応による蛍光が割球および残存している極体の細胞質に観察され、MCー1aとのインキュベ-ションによっては特異的な蛍光は認められなかった。本研究により、マウスでは一次卵母細胞から胚盤胞までは、Cキナ-ゼ・アイソザイムの少なくとも2種類(II型、III型)が存在することがわかった。

1.卵母细胞中蛋白激酶C（以下简称C-激酶）同工酶的论证（1）将C-激酶添加至B6C3F_1小鼠-Ze同工酶I型中。、 II 和 III 分别当使用特异性单克隆抗体MC-1a、MC-2a和MC-3a进行免疫荧光光染色时，观察到由于与MC-2a和MC-3a反应而产生的荧光，而与MC-1a孵育时没有观察到特异性荧光。换句话说，发现小鼠初级和次级卵母细胞中存在II型和III型C激酶同工酶。 (2)将非洲爪蟾次级卵母细胞匀浆液以100,000×g离心得到的上清液进行DEAE纤维素柱层析和SDS-PAGE，使用上述三种类型的单克隆抗体进行免疫印迹时，在分子量约为每种抗体 80,000 个。这些结果表明，所有 I、II 和 III 型 C 激酶同工酶都存在于非洲爪蟾次级卵母细胞的可溶性部分中。 2. 植入前小鼠胚胎MC-1a、MC-2a中C激酶同工酶的证明，并使用MC-3a进行免疫荧光染色。在各阶段的胚胎中，在卵裂球和剩余极体的细胞质中均观察到由于与MC-2a和MC-3a反应而产生的荧光；未观察到特异性荧光。这项研究表明，从初级卵母细胞到囊胚的小鼠体内至少存在两种类型的 C 激酶同工酶（II 型和 III 型）。