燐酸化チロシンに対する特異的モノクロ-ナル抗体の開発と量変化ー腫瘍の診断ならびに情報伝達機構の解明のためにー

磷酸化酪氨酸特异性单克隆抗体的开发及其量的变化 - 用于肿瘤的诊断和信息传递机制的阐明 -

• 批准号: 63870030
• 负责人: 春日 雅人
• 金额: $ 13.25万
• 依托单位: Kobe University (1990)The University of Tokyo (1988-1989)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 1990
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63870030/
• 关键词: Vーabl; I型Pエキナ-ゼ活性; phosphotyramine; 燐酸化チロシン; モノクロナル抗体

本年度は、燐酸化チロシンに対する抗体を作製する時の抗原として、チロシン燐酸化酵素をコ-ドする癌遺伝子vーablを大腸菌に発現させ大腸菌中のさまざまな蛋白をチロシン燐酸化させたものを抗原として用いた。BALB/Cマウスのhind padに上記の大腸菌蛋白を200〜400μg,3日〜4日おきに4回注射免疫し、最終免疫4日後にリンパ節より得たリンパ球1×10^8個とSP2/0ミエロ-マ細胞3×10^7個をPEG法にて細胞融合を行った。スクリ-ニングには自己燐酸化インスリン受容体の免疫沈降を用いた。その結、燐酸化チロシンに対する特異的モノクロナル抗体1D7を得ることができた。この抗体についてその特異性を検討すると、イムノブロッティング法において、インスリン刺激後の細胞において95Kのインスリン受容体βサブユニット,64K,61K,54K,41Kの蛋白を認識し、これらは燐酸化チロシンの存在により消失したが、燐酸化セリン、燐酸化スレオニンの存在では全く影響をうけなかった。以上より、このモノクロナ-ル抗体が、燐酸化チロシンを特異的に認識しているのは明らかである。また、インスリン刺激後に認識されるチロシン燐酸化蛋白についても、昨年度迄に我々が作製したモノクロナル抗体あるいはすでに米国において市販されている抗燐酸化チロシンモノクロナル抗体PY20とかなり異ることが明らかとなった。すなわち,185Kのチロシン燐酸化蛋白は、我々が作製したモノクロナル抗体でよく認識されるが、今回の1D7やPY20ではあまりよく認識されない。一方、I型PIキナ-ゼ活性は、PY20によりよく免疫沈降されるが、1D7ではその10%程度しか免疫沈降されないことが明らかとなった。

今年，作为一种用于对磷酸化酪氨酸产生抗体的抗原，通过表达癌基因V-ABL（在大肠杆菌中用酪氨酸磷酸化酶编码），使用抗原，在大肠杆菌中使用酪氨酸磷酸化酶代码，而在大肠杆菌中使用了各种蛋白质。每3-4天对BALB/C小鼠的后垫进行四次免疫四次注射上述大肠杆菌蛋白，并在最终免疫后，通过PEG方法从淋巴结中获得1×10^8淋巴细胞和3×10^7 SP2/0的淋巴瘤细胞。自磷酸化胰岛素受体的免疫沉淀用于筛查。通过获得磷酸化酪氨酸的特定单克隆抗体1d7获得了结果。当研究了该抗体的特异性时，免疫印迹表明，胰岛素刺激后的细胞中识别出95K，64K，61K，54K和41K的蛋白质，尽管在磷酸化的酪氨酸的存在下消除了这些蛋白质，但它们对磷酸化的丝氨酸或磷酸化的泰氏蛋白没有影响。从上面可以明显看出，这种单克隆抗体专门识别磷酸化的酪氨酸。还已经显示，胰岛素刺激后识别的酪氨酸磷酸化蛋白与我们去年产生的单克隆抗体明显不同，或者是抗磷酸化的酪氨酸酪氨酸单克隆抗体PY20，该抗体PY20已在美国已市市可用。换句话说，我们产生的单克隆抗体可以很好地识别185K酪氨酸磷酸化的蛋白质，但这次的1D7和PY20并不是很好地识别。另一方面，已经揭示了I型Pi Quinase活性通常通过PY20进行免疫沉淀，但只有大约10％的活性用1D7免疫沉淀。

项目成果

Tashiro-Hashimoto,Y.,Tobe,K.,Koshio,O.,Izumi,T.,Takaku,F.,and Kasuga,M.: "Tyrosine-phosphorylation of pp185 by insulin receptor kinase in a cell free system." (J.Biol.Chem.). 264. 6879-6885 (1989)

Tashiro-Hashimoto,Y.、Tobe,K.、Koshio,O.、Izumi,T.、Takaku,F. 和 Kasuga,M.：“无细胞系统中胰岛素受体激酶对 pp185 的酪氨酸磷酸化。”

R.Yamamoto,T.Shiba,K.Tobe,Y.Shibasaki,O.Koshio,T.Izumi,M.Odawara,Y.Mikami,N.Matsuura,Y.Akanuma,F.Takaku,M.Kasuga: "Defect in tyrosine kinase activity of the insulin receptor from a patient with insulin resistance and acanthosis nigricans," J.Clin.Endocrin

R.Yamamoto、T.Shiba、K.Tobe、Y.Shibasaki、O.Koshio、T.Izumi、M.Odawara、Y.Mikami、N.Matsuura、Y.Akanuma、F.Takaku、M.Kasuga：“缺陷

Takayama-Hasumi,S.;Tobe,K.;Momomura,K.;Koshio,O.;Tashiro-Hashimoto,Y.;Akanuma,Y.;Hirata,Y.;Takaku,F.;Kasuga,M.: J.Clin.Endocrinal.Metab.(1989)

高山莲见，S.；户部，K.；桃村，K.；小潮，O.；田代桥本，Y.；赤沼，Y.；平田，Y.；高久，F.；春日，M.：J

Koshio,O.,Akanuma,Y.,and Kasuga,M.: "Identification of a phosphorylation site of the rat insulin receptor catalized by protein kinase C in an intact cell." (FEBS Lett.). 254. 22-24 (1989)

Koshio,O.、Akanuma,Y. 和 Kasuga,M.：“完整细胞中蛋白激酶 C 催化的大鼠胰岛素受体磷酸化位点的鉴定”。

Odawara,M.,Kadowaki,T.,Yamamoto,R.,Shibasaki,Y.,Tobe,K.,Accili,D.,Bevins,C.,Mikami,Y.,Matsuura,N.,Akanuma,Y.,Takaku,F.,Taylor,S.I.,and Kasuga,M.: "Human diabetes associated with a mutation in the tyrosine kinase domain of the insulin receptor." (Science).

小田原 M.、门胁 T.、山本 R.、柴崎 Y.、户部 K.、阿奇利 D.、贝文斯 C.、三上 Y.、松浦 N.、赤沼 Y.、