蛍光プローブによる筋小胞体カルシウムポンプの分子内作動機構に関する研究

荧光探针研究肌浆网钙泵分子内运行机制

基本信息

批准号：
63580142
负责人：
金沢徹
金额：
--
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.筋小胞体Ca^<2+>-ATPase(Caポンプ)の特異的SH基(Cys^<674>)を蛍光プローブ(I-EDANS)で選択的ラベルし、通常の蛍光光度計とストップトフロー蛍光光度計を用いてCa^<2+>-ATPaseの全触媒過程にわたりラベルの蛍光強度と定常状態蛍光異方性を測定し、次の結果を得た。(1)酵素のCa^<2+>輸送部位にCa^<2+>が結合して酵素が活性化されるとき、蛍光強度と蛍光異方性が若干増大した。(2)Ca^<2+>で活性化された酵素の触媒部位にATPが結合するとき、蛍光強度と蛍光異方性が著明に減少した。(3)反応の過程でリン酸化酵素中間体がADP感受性型からADP非感受性型に変換されるとき、蛍光強度と蛍光異方性が若干減少した(4)逆反応でpiからリン酸化酵素中間体が形成されるとき、蛍光強度と蛍光異方性が著明に減少した。これらの結果は、Ca^<2+>の結合によって酵素が活性化されるときラベルの運動性を制限するような構造変化がラベル近傍で起こること、Ca^<2+>で活性化された酵素の触媒にATPが結合するときラベルの運動性を増大させるような構造変化がラベル近傍で起こること、この構造変化が全触媒過程にわたってdominantであることを示している。更に、この結果は、酵素の触媒部位にATPが結合すると、Cys^<674>に結合したラベルの微環境がより弛緩した状態になること、及びこの弛緩した状態が全触媒過程にわたってdominantであることを示している。2.先に、我々は筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの触媒過程における酵素の異性化がA23187により選択的に阻害されることを示した。本研究では、同じP-typeに属するNa^+,K^+-ATPaseについてA23187の作用を検討し、筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseに対する作用と比較した。その結果、Ca^<2+>-ATPaseの場合と同様、A23187はNa^+,K^+-ATPaseの触媒過程における酵素の異性化を選択的に阻害することが示された。従って、これらのP-type ATPaseにはA23187で阻害される共通の機構が存在すると推定される。

1.用荧光探针（I-EDANS）选择性标记肌浆网Ca^<2+>-ATPase（Ca泵）的特定SH基团（Cys^<674>），并使用常规荧光计停止我们测量荧光使用Toflow荧光计测量了Ca^2+-ATPase整个催化过程中标记物的强度和稳态荧光各向异性，得到以下结果。 (1)当Ca^2+与酶的Ca^2+转运位点结合并激活酶时，荧光强度和荧光各向异性略有增加。 (2)当ATP与Ca^2+激活酶的催化位点结合时，荧光强度和荧光各向异性显着降低。 (3)当反应过程中磷酸化酶中间体从ADP敏感形式转化为ADP不敏感形式时，荧光强度和荧光各向异性略有下降。(4)在逆反应中，磷酸化酶中间体发生转化。 pi 当小体形成时，荧光强度和荧光各向异性显着降低。这些结果表明，当酶被 Ca^<2+> 结合激活时，标记附近会发生结构变化，从而限制了标记的移动性。增加了标签的流动性，并且这种结构变化在整个催化过程中占主导地位。此外，该结果表明ATP与酶的催化位点的结合导致Cys^<674>结合标记的微环境更加宽松，并且表明这种松弛状态在整个催化过程中占主导地位。 2.之前我们发现A23187选择性地抑制肌浆网Ca^2+-ATP酶催化过程中酶的异构化。在本研究中，我们研究了A23187对同属于P型的Na^+,K^+-ATPase的影响，并与其对肌浆网Ca^2+-ATPase的影响进行了比较。结果表明，与Ca^2+-ATPase的情况类似，A23187选择性地抑制Na^+,K^+-ATPase催化过程中酶的异构化。因此，推测这些P型ATP酶具有被A23187抑制的共同机制。