筋小胞体カルシウムポンプの触媒部位の構造と機能

肌浆网钙泵催化位点的结构和功能

• 批准号: 06680600
• 负责人: 金沢 徹
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Asahikawa Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680600/
• 关键词: 筋小胞体; カルシウムポンプ; カルシウムATPアーゼ; 分子機構; 反応機構; 構造・機能解析

1.筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのジスルフィド結合がCa^<2+>とプリンヌクレオチド(またはその非加水分解性アナログ)存在下でのみジチオスレイトール(DTT)で還元されること、およびこの還元によってCa^<2+>-ATPaseの特定反応ステップ(リン酸化中間体の異性化)が選択的に阻害されることを明らかにした。この結果は、Ca^<2+>で活性化されたCa^<2+>-ATPaseとプリンヌクレオチドの複合体形成に際して起こる構造変化でジスルフィド結合が、添加したDTTに対して露出されることを示している(J.Biol.Chem.269,11060-11064,1994)。2.筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseにおけるATPによるトリプトファンの蛍光変化は、ATPaseの反応サイクルにおけるADP感受性リン酸化酵素形成に伴う構造変化を反映することを、ストップトフロー蛍光分光測定とラピッドクウエンチング法を用いて明らかにした(J.Biol.Chem.269,16015-16019,1994)。3.蛍光性試薬でCys-674を特異的に標識した筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseを用いて、ストップトフロー蛍光分光測定とラピッドクエンチング法により、反応初期相における構造変化に対する二価カチオンの影響を調べた。Ca^<2+>・酵素・基質複合体形成時の構造変化は、二価カチオンの影響を受けなかったが、ADP感受性リン酸化酵素形成時の構造変化は二価カチオンによって著明に影響されることを明らかにした(Biochemistry 33,8240-8246,1994)。4.筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのリン酸化中間体の異性化に際して、トリプトファンの蛍光変化を伴う構造変化が起こることを、K^+非存在下、ラサロシド存在下で示した((J.Biol.Chem.270,Feb.,1995 in press)。

1.肌浆网Ca 2+ -ATP酶的二硫键仅在Ca 2+ 和嘌呤核苷酸(或其不可水解类似物)存在的情况下被二硫苏糖醇(DTT)还原。还原选择性地抑制Ca 2+ -ATP酶的特定反应步骤(磷酸化中间体的异构化)。该结果表明，由于Ca 2+ -ATP酶和被Ca 2+ 激活的嘌呤核苷酸之间形成复合物期间发生的结构变化，二硫键暴露于添加的DTT(J.生物，269，11060-11064，1994）。 2.停流荧光光谱表明，肌浆网Ca ^ 2+ -ATP酶中ATP诱导的色氨酸荧光变化反映了ATP酶反应循环期间与ADP敏感激酶形成相关的结构变化。快速猝灭法（J. Biol. Chem. 269, 16015-16019, 1994）。 3.利用荧光试剂特异性标记Cys-674的肌浆网C​​a^2+-ATPase，我们利用停流荧光光谱和快速猝灭研究了反应初始阶段结构变化对二价阳离子的影响。被调查。 Ca 2+ -酶-底物复合物形成过程中的结构变化不受二价阳离子的影响，但ADP敏感激酶形成过程中的结构变化明显受到二价阳离子的影响(Biochemistry 33, 8240-8246, 1994）。 4. 我们发现，在不存在 K^+ 且存在拉沙洛西的情况下，肌浆网 Ca^2+-ATPase 磷酸化中间体异构化过程中会发生结构变化，并伴有色氨酸荧光的变化（(J.生物化学，270，1995 年 2 月出版）。

项目成果

Hiroshi Suzuki and Tohru Kanazawa: "The Tryptophan Fluorescence Change upon Conformational Transition of the Phosphoenzyme Intermediate in Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase Is Revealed in the Absence of K^+ and the Presence of Lasalocid" THE JOURNAL O

Hiroshi Suzuki 和 Tohru Kanazawa：“在 K^ 不存在和拉沙里菌存在的情况下，肌浆网 Ca^<2>-ATP 酶中磷酸酶中间体构象转变时的色氨酸荧光变化” THE JOURNAL O

Satoshi Nakamura,Hiroshi Suzuki,and Tohru Kanazawa: "The ATP-induced Change of Tryptophan Fluorescence Reflects a Conformational Change upon Formation of ADP-sensitive Phosphoenzyme in the Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase STOPPED-FLOW SPECTROFLUOROME

Satoshi Nakamura、Hiroshi Suzuki 和 Tohru Kanazawa：“ATP 诱导的色氨酸荧光变化反映了肌浆网 Ca^<2>-ATP 酶停止流动荧光光谱中 ADP 敏感磷酸酶形成时的构象变化

Takashi Daiho and Tohru Kanazawa: "Reduction of Disulfide Bonds in Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase by Dithiothreitol Causes Inhibition of Phosphoenzyme Isomerization in Catalytic Cycle THIS REDUCTION REQUIRES BINDING OF BOTH PURINE NUCLEOTIDE AND Ca

Takashi Daiho 和 Tohru Kanazawa：“二硫苏糖醇还原肌浆网 Ca^2-ATP 酶中的二硫键会抑制催化循环中的磷酸酶异构化，这种还原需要嘌呤核苷酸和 Ca 结合

Hiroshi Suzuki,Satoshi Nakamura,and Tohru Kanazawa: "Effects of Divalent Cations Bound to the Catalytic Site on ATP-Induced Conformational Changes in the Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase:Stopped-Flow Analysis of the Fluorescence of N-Acetyl-N'-(5-sul

Hiroshi Suzuki、Satoshi Nakamura 和 Tohru Kanazawa：“结合到催化位点的二价阳离子对肌浆网 Ca^<2>-ATP 酶中 ATP 诱导的构象变化的影响：N-乙酰基荧光的停流分析