筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの構造と機能-化学修飾と部位特異的変異による研究

肌浆网Ca^2+-ATP酶的结构和功能——化学修饰和位点特异性突变研究

• 批准号: 08680671
• 负责人: 金沢 徹
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Asahikawa Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680671/
• 关键词: 筋小胞体; カルシウムポンプ; カルシウムATPアーゼ; 構造解析; 機能解析; 化学修飾; 部位特異的変異; 分子機構

1.筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseをアルギニン残基指向性試薬cyclohexanedione(CHD)を用いて修飾した。この修飾によるCa^<2+>-ATPaseの各部分反応の阻害と、それに対する各種基質(ATP、ADP、AMP)の保護効果を調べることにより、次のことを明らかにした。(1)Ca^<2+>-ATPaseのArg-489とArg-678は、触媒部位のATP結合部位のうち、ATPのαーリン酸基が占める領域またはそのごく近傍に位置している。(2)CHD修飾による酵素阻害に関与するアルギニン残基は、Arg-489またはArg-678(またはその両者)である(J.Biol.Chem.271,28933-28941,1996)。2.筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseをヒスチジン残基指向性試薬diethyl pyrocarbonate(DEPC)を用いて修飾した。この修飾によるCa^<2+>-ATPaseの各部分反応の阻害と、それに対する各種基質の保護効果を調べることにより、Ca^<2+>-ATPaseのHis-5がリン酸化中間体の加水分解に関与していることを明らかにした(in preparation)。3.上記の各種アミノ酸残基について、部位特異的変異による機能解析が現在進行中である。4.筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseにおいて、リン酸化とFITC(fluorescein 5-isothiocyanate)結合のstoichiometryが0.5:1.0であることを明らかにした(J.Biol.Chem.272,6232-6251,1997)。

1.使用精氨酸残基导向试剂环己二酮(CHD)修饰肌浆网Ca 2+ -ATP酶。通过研究该修饰对Ca ^ 2+ -ATP酶各部分反应的抑制以及各种底物(ATP、ADP和AMP)对其的保护作用，我们澄清了以下内容。 (1)Ca 2+ -ATP酶的Arg-489和Arg-678位于ATP的α-磷酸基所占据的区域中的催化位点的ATP结合位点或其附近。 (2)通过CHD修饰参与酶抑制的精氨酸残基是Arg-489或Arg-678(或两者)(J.Biol.Chem.271, 28933-28941, 1996)。 2.使用焦碳酸二乙酯(DEPC)修饰肌浆网Ca 2+ -ATP酶，DEPC是一种靶向组氨酸残基的试剂。通过研究这种修饰对Ca^2+-ATPase各部分反应的抑制以及各种底物对其的保护作用，我们发现Ca^2+-ATPase的His-5负责水合作用。 Ca^2+-ATP酶的磷酸化中间体的研究表明它参与分解(制备中)。 3.目前正在使用定点诱变对上面列出的各种氨基酸残基进行功能分析。 4.在肌浆网Ca 2+ -ATP酶中，磷酸化和FITC(荧光素5-异硫氰酸酯)结合的化学计量为0.5:1.0(J.Biol.Chem.272,6232-6251,1997) 。

项目成果

Keisuke Kimura,Hiroshi Suzuki,Takashi Daiho,Kazuo Yamasaki,Tohru Kanazawa: "Idendtification of Arginyl Residues Located at the ATP Binding Site of Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase : MODIFICATION WITH 1,2-CYCLOHEXANEDIONE." The Journal of Biological C

Keisuke Kimura、Hiroshi Suzuki、Takashi Daiho、Kazuo Yamasaki、Tohru Kanazawa：“位于肌浆网 Ca^<2 >-ATP 酶 ATP 结合位点的精氨酰残基的鉴定：用 1,2-环己烷二酮进行修饰。”

Satoshi Nakamura,Hiroshi Suzuki,Tohru Kanazawa: "Stoichiometry of Phosphorylation to Fluorescein 5-Isothiocyanate Binding in the Ca^<2+>-ATPase of Sarcoplasmic Reticulum Vesicles." The Journal of Biological Chemistry. 272・10. 6232-6251 (1997)

Satoshi Nakamura、Hiroshi Suzuki、Tohru Kanazawa：“肌浆网囊泡 Ca^<2+>-ATP 酶中荧光素 5-异硫氰酸酯磷酸化的化学计量”，《生物化学杂志》272・10。 ）