横紋筋リボソームの破綻が引き起こす心機能不全の分子機構の解明

阐明横纹肌核糖体破坏引起心功能障碍的分子机制

• 批准号: 22K19531
• 负责人: 松本 有樹修
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19531/
• 关键词: 横紋筋リボソーム; 拡張型心筋症; Ribo-seq; リボソーム; 心臓

われわれは、横紋筋にはRPL3を含む「構成型リボソーム」とRPL3Lを含む「横紋筋リボソーム」の両方が存在することを見出した。さらに、RPL3L KOマウス（= 横紋筋リボソームを欠損）は心臓の収縮能の低下を示し、心臓の収縮に関与する遺伝子など一部の遺伝子で翻訳活性が低下することをRibo-seq解析により見出していた。そこで、本課題では「構成型リボソーム」と「横紋筋リボソーム」にどのような質的な違いがあるかを明らかにしていくことを目標としている。【1】RPL3L KOマウスの心臓の経時的観察と病理学的解析：これまでに12週齢のRPL3L KOマウスにおいて、有意に心臓の収縮能の低下が観察されているため、老化によりさらに症状が悪化するかを検討するために、１０ヶ月齢のマウスなども用いて解析を行ったが、さらなる症状の悪化は観察されなかった。また心臓の圧負荷などを行っても、さらなる悪化は見られなかった。【2】タグノックインマウスを作製して標的mRNAに違いがないかを検討する：RPL3もしくはRPL3LにHAタグ配列をノックインしたマウスを作製した。さらに、ノックインマウスの心臓のサンプルを用いてHAタグ抗体の免疫沈降で精製し、IP-Ribo-seqなどを行なった。RPL3L-HAのIP-Ribo-seqでは心臓の収縮にかかわる遺伝子などが、RPL3-HAと比較してより濃縮されていた。【3】クライオ電子顕微鏡解析により構造基盤を明らかにする：横紋筋リボソームの構造をクライオ電子顕微鏡で解析することにより、mRNAや周辺のリボソームサブユニット、アミノアシルtRNA、rRNAとの相互作用領域が、RPL3（構成型リボソーム）とRPL3L（横紋筋リボソーム）でどのように異なるかを解析する。HEK293T細胞にRPL3Lを過剰発現してからRPL3をノックアウトすることにより、横紋筋リボソームのみが存在する細胞の作製を試みたが、その様な細胞を得ることができなかった。

我们发现，横纹肌肉具有含有RPL3和含有RPL3L的“构型核糖体”。此外，核糖表分析表明，RPL3L KO小鼠（缺乏条纹肌肉核糖体）表现出心脏收缩性的降低，并且在某些基因中降低了转化活性，包括涉及心脏收缩的基因。因此，该主题旨在阐明“构型核糖体”和“链状核糖体”之间的质量差异。 [1]基于时间的RPL3L KO小鼠心脏的基于时间的观察和病理分析：由于已经在12周龄的RPL3L KO小鼠中观察到心脏收缩性的显着降低，因此使用10个月大的小鼠进行了分析以确定症状是否因衰老而导致症状是否恶化，但没有观察到症状的进一步恶化。此外，即使在心脏上施加压力后，也没有观察到进一步的恶化。 [2]制作TAG敲入小鼠以检查目标mRNA是否存在差异：将HA标签序列敲入RPL3或RPL3L中的小鼠。此外，通过对HA-TAG抗体的免疫沉淀纯化了敲入小鼠的心脏样品，并进行了IP-ribo-Seq等。在RPL3L-HA的IP-ribo-seq中，与RPL3-HA相比，涉及心脏收缩的基因更集中。 [3]冷冻电子显微镜分析揭示了结构基础：通过使用冷冻电子显微镜分析条纹肌肉核糖体的结构，我们分析了mRNA之间的相互作用区域，周围的核糖体亚基，氨基酰基TRNA和RRNA之间的相互作用区域如何不同尽管我们试图创建仅通过在HEK293T细胞中过表达RPL3L而存在的细胞，但我们无法获得此类细胞。