塩基性薬物輸送を担う血液脳関門オーファントランスポーターの機能解明

阐明负责基本药物转运的血脑屏障孤儿转运蛋白的功能

基本信息

批准号：
17K15521
负责人：
樋口慧
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Teikyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-01 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、血液脳関門（BBB)におけるオーファントランスポーターSLC12A9およびSLC45A4の輸送機能を解明し、塩基性薬物の脳移行性に与える影響について明らかにすることを目的とした。まずヒトBBBモデル細胞であるhCMEC/D3細胞におけるSLC12A9およびSLC45A4発現のmRNA発現を確認した。その後、両トランスポーター遺伝子ノックダウンがが薬物取り込みに与える影響をsiRNAを用いて検討した。その結果、SLC45A4ノックダウンをした細胞では、塩基性薬物取り込みが一部減少することを新たに見出した。一方でSLC12A9ノックダウンでは塩基性薬物取り込みが増加した。このことから、両オーファントランスポーターがヒトBBB モデル細胞における塩基性薬物取り込みに何らかの影響を与えうることを示した重要な知見であると考えられる。次に各トランスポーター強制発現させたHEK293 細を用いて、直接的薬物取り込み能を評価したが、mock細胞の取り込みとの差は観察されなかった。そこでホスト細胞での内在性トランスポーターをノックアウトした実験系の構築を目指して、hCMEC/D3細胞にCRISPER-Cas9システムによるトランスポーターノックアウト細胞の調製を行った。hCMEC/D3 細胞におけるCRIPSER-Cas9システムの適応条件をABCB1遺伝子を用いて検討を行い、当該システムがhCMEC/D3細胞に適応し、トランスポーターノックアウトが可能であることを確認した。hCMEC/D3由来SLC45A4ノックアウトした候補細胞の調製を完了した。それらの細胞を用いることで、詳細なBBBオーファントランスポーターの輸送機能解析が可能となることが期待される。

在这项研究中，目的是阐明血液脑神经化（BBB）Orfan运输人SLC12A9和SLC45A4的运输功能，并阐明对基本药物迁移的影响。首先，证实了HCMEC/D3细胞中SLC12A9和SLC45A4表达的mRNA表达（人类BBB模型细胞）。之后，使用siRNA检查了两个转运蛋白基因敲低对药物进口的影响。结果，新发现的是，SLC45A4敲击细胞部分减少了碱性药物掺入。另一方面，在SLC12A9敲低中，基本药物进口增加。由此，认为两种Orofan转运蛋白都会影响人BBB模型细胞中的基本药物进口的重要知识。接下来，使用被迫表达每个转运蛋白的HEK293罚款进行了直接的药物掺入评估，但观察到模拟细胞掺入的差异。因此，为了构建一个在宿主细胞中敲打内部转运蛋白的实验系统，使用Crisper-Cas9系统将转运蛋白基因敲除细胞准备到HCMEC/D3细胞。使用ABCB1基因检查了HCMEC/D3细胞中Cripser-Cas9系统的适应条件，并确认该系统适应了HCMEC/D3细胞，并可以进行转运蛋白敲除。 HCMEC/D3衍生的SLC45A4候选细胞制剂已经完成。通过使用这些细胞，预计详细的BBB Orfan运输将能够分析运输功能分析。