疾患特異的iPS細胞を利用した先天性好中球減少の病態解明と新規治療薬探索

利用疾病特异性 iPS 细胞阐明先天性中性粒细胞减少症的病理学并寻找新的治疗药物

基本信息

批准号：
15K19618
负责人：
溝口洋子
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15K19618/
关键词：
先天性好中球減少症 iPS細胞

项目摘要

すでに樹立済みの健常人由来iPS細胞（WT-iPS）、先天性好中球球減少症由来iPS細胞(SCN-iPS、変異部位ELANE C194X)、周期性好中球減少症由来iPS細胞（CyN-iPS、変異部位ELANE R191Q）をマウス由来AGM-3S feeder細胞と共培養し、VEGF添加にて造血系に分化誘導させ、FACS AriaにてCD34陽性細胞に純化した。その後CD34陽性細胞を各種サイトカイン（SCF、IL-3、G-CSF、FLAT3、FP6）を用いてコロニーアッセイ及び液体培養にて顆粒球分化誘導を行った。コロニーアッセイでは14日目に評価を行い、SCN-iPSにおいてWT-iPS, Cy-iPSと比較し明らかに顆粒球マクロファージコロニーおよび顆粒球コロニー数の減少を認め、これは患者骨髄CD34陽性細胞を用いて行った同実験と同等の結果であった。また液体培養で得られた顆粒球は、培養7日目に評価を行い、形態学的に核の分葉を認め好中球様であった。フローサイトメトリーによる表面抗原解析を行い、顆粒球抗原であるCD13, CD33, CD11bの発現を確認した。細胞内MPO染色でも陽性を確認した。SCN-iPSにおいてはWT-iPS, Cy-iPSと比較し、細胞数の増加が乏しかった。また培養7日目に施行した形態学的所見において、WT-iPS, Cy-iPSでは成熟好中球を約半数以上に認めたが、SCN-iPSにおいては成熟好中球はわずかに認めるのみであり、死細胞を30%程度に認めた。培養10日目に行ったapoptosis assayにおいてはSCN-iPSではAnnexinV陽性細胞を約60%に認め、これはWT-iPS, Cy-iPSと比較し明らかに高値であった。SCN-iPS由来の好中球において細胞死の亢進を認め、これらは患者骨髄で認められた所見と同等であり、実証モデルとして使用可能であることを証明した。

已经建立了健康的人源性IPS细胞（WT-IPS），先天性良好中性粒细胞IPS细胞（SCN-IPS，突变位点Elane C194X），周期性良好中性良好中性ips降低IPS细胞（CYN ---）IPS，突变位点Elane R191Q）与小鼠衍生的AGM-3馈物细胞共培养，衍生在VEGF中的造血系统，并将其纯化为FACS ARIA中的CD34阳性细胞。此后，使用各种细胞因子（SCF，IL-3，G-CSF，FLAT3，FP6）提供了CD34阳性细胞。菌落测定在第14天进行，在SCN-IPS中，与WT-IPS和CY-IPS相比，它可以减少粒细胞巨噬细胞菌落的数量和颗粒菌落菌落的数量与同一实验的结果相同。在培养的第7天评估了通过液态培养物获得的粒细胞，并以中性球的形式认识到核武器的叶子。表面抗原分析通过流部位计量表进行，并且证实了粒状抗原的CD13，CD33和CD11b的表达。细胞MPO中的阳性得到了证实。在SCN-IPS中，与WT-IP和CY-IPS相比，细胞数量的增加很差。同样，在培养的第七天生效的形态学发现中，WT-ip和Cy-ips识别出一半以上的成熟中性粒细胞，但是在SCN-IPS中，成熟的中性粒细胞仅允许。约为30％。在培养第10天举行的凋亡测定中，SCN-IPS认可了约60％的附毒性细胞，与WT-IPS Cy-ips相比，这显然很昂贵。源自SCN-IP的良好中性球的细胞死亡增加，并证明它们等同于患者骨髓中识别的发现，并且可以用作示范模型。