γセクレターゼによる膜内配列切断・分解機構の解明

阐明γ-分泌酶膜内序列切割和降解的机制

基本信息

批准号：
15016027
负责人：
富田泰輔
金额：
$ 4.42万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15016027/
关键词：
痴呆神経化学脳神経疾患老化アルツハイマー γセクレターゼ

项目摘要

アミロイド産生阻害を目的としたアルツハイマー病治療薬開発の上で、γ-セクレターゼによる切断機構の分子レベルでの理解は必須である。これまでの知見からγ-セクレターゼには基質がまず安定に結合する部位が存在し、何らかのメカニズムにより活性中心部位へ基質が遷移し、切断を受けることが示唆されている。したがってγ-セクレターゼの阻害作用点は複数あることが想定され、それらの理解により特異性が高く、副作用の少ない阻害剤の同定・合成が可能になるものと考えられる。そこでγ-セクレターゼ阻害剤であるDAPTによる阻害機構のターゲット分子の同定を試みた。まずDAPTに光親和性標識基であるベンゾフェノンと検出・精製のためのビオチン基を付加したDAP-BpBを作製し、親化合物であるDAPTとほぼ同等の阻害能を持つことを確認した(東大・薬、福山教授・菅助手らとの共同研究)。そこでHeLa細胞由来の可溶性膜画分を利用して光親和性標識を行い、DAP-BpBが活性型γ-セクレターゼ複合体に含まれるPS1 C末端フラグメントを特異的に認識することが明らかとなった。このDAP-BpBによる標識はDAPTと類似した構造を持つジペプチド型阻害剤により競合阻害されたが、活性中心部位に相互作用すると考えられるL-685,458や基質結合部位に相互作用すると考えられるAibペプチドとは競合しなかった。これらのことから、DAPTを含んだジペプチド型阻害剤は、基質がγ-セクレターゼ複合体に結合した後に活性中心へ遷移する過程を特異的に阻害すること、その過程にPS1のC末端フラグメントが関与していることが示唆された。

在分子水平上了解 γ-分泌酶的裂解机制对于开发旨在抑制淀粉样蛋白产生的阿尔茨海默病疗法至关重要。先前的研究结果表明，γ-分泌酶有一个底物首先稳定结合的位点，并且底物通过某种机制转移到活性中心位点并进行裂解。因此，推测抑制γ-分泌酶有多个作用位点，了解它们将能够鉴定和合成特异性高、副作用小的抑制剂。因此，我们试图鉴定γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制机制的靶分子。首先，我们通过在DAPT中添加二苯甲酮、光亲和标记基团和用于检测和纯化的生物素基团来创建DAP-BpB，并确认其具有与母体化合物DAPT（东京大学医学）几乎相同的抑制能力，与福山教授和须贺助理共同研究）。使用来自 HeLa 细胞的可溶性膜组分进行光亲和标记，结果表明 DAP-BpB 特异性识别激活的 γ-分泌酶复合物中包含的 PS1 C 末端片段。这种 DAP-BpB 标记受到与 DAPT 结构相似的二肽型抑制剂的竞争性抑制，但它也受到 L-685,458（被认为与活性中心位点相互作用）和 Aib 肽（被认为与活性中心相互作用）的抑制。与底物结合位点不竞争。这些结果表明，含有DAPT的二肽型抑制剂特异性抑制与γ-分泌酶复合物结合后底物向活性中心转变的过程，并且表明PS1的C末端片段参与了该过程。