アルツハイマー病発症機構におけるプレセニリンとγセクレターゼの機能解析

早老素和γ-分泌酶在阿尔茨海默病发病机制中的功能分析

基本信息

批准号：
15689002
负责人：
富田泰輔
金额：
$ 9.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15689002/
关键词：
アルツハイマー βアミロイドプレセニリン

项目摘要

γ-セクレターゼはAPPの膜内配列を切断し、アルツハイマー病発症に深く関連するβアミロイド蛋白の最終段階を担う酵素である。その分子的本態として、家族性アルツハイマー病原因遺伝子の一つであるPresenilinを活性中心とした、Nicastrin(Nct)、Aph-1、Pen-2によって構成される高分子量膜蛋白複合体であることが明らかとなっている。特異的な阻害剤の開発やその高次構造の理解のためには、活性を持つ酵素の高効率な発現・精製法の確立が必須であるが、複数の膜蛋白によって構成される複合体という特性のため、通常の発現系では困難であった。そこでバキュロウイルス発現系において、感染Sf9細胞から出芽するウイルスに活性を持つ膜蛋白複合体が効率よく濃縮されるという現象を利用することを考え、4分子それぞれをコードするリコンビナントバキュロウイルスを作製し、Sf9細胞に感染させた(東大・先端研、浜窪・児玉教授との共同研究)。その結果4分子すべくを感染させたときに初めて活性型γ-セクレターゼ複合体がSf9細胞膜画分および出芽ウイルス画分に再構成され、その酵素学的性質は哺乳類細胞のそれとほぼ同様であった。さらにSf9細胞には不活性型γ-セクレターゼをあらわすと考えられる全長型PSが多く存在していたのに対し、出芽ウイルス画分には活性型γ-セクレターゼの特異的な集積が観察された。この方法により活性型γ-セクレターゼを特異的に産生・精製することが可能となったほか、多種の膜結合性サブユニットからなる高分子量膜蛋白複合体を効率よく再構成することが可能となることが示唆された。

γ-分泌酶是一种切割APP膜内序列的酶，负责产生β-淀粉样蛋白的最后一步，与阿尔茨海默病的发病密切相关。其分子本质是由Nicastrin（Nct）、Aph-1和Pen-2组成的高分子量膜蛋白复合物，以导致家族性阿尔茨海默病的基因之一早老素（Presenilin）为活性中心。为了开发特异性抑制剂并了解其高级结构，必须建立活性酶的高效表达和纯化方法，由于其特性，很难使用常规表达系统。因此，在杆状病毒表达系统中，我们考虑利用活性膜蛋白复合物有效浓缩在从受感染的Sf9细胞中出芽的病毒中的现象，并创建了编码被感染的Sf9细胞中的每一种分子的重组杆状病毒（与Hamakubo教授的合作研究）。和东京大学尖端科学技术研究所 Kodama）。结果，仅当四个分子被感染时，活性γ-分泌酶复合物就被重构为Sf9细胞膜级分和出芽病毒级分，其酶学性质几乎与哺乳动物细胞相似。此外，Sf9细胞含有大量全长PS，这被认为代表失活的γ-分泌酶，而在出芽病毒部分中观察到活性γ-分泌酶的特异性积累。该方法不仅使得特异性生产和纯化活性γ-分泌酶成为可能，而且使得有效地重建由各种膜结合亚基组成的高分子量膜蛋白复合物成为可能。