外来遺伝子導入法を用いた高等植物の転写調節DNA領域の解析

外源基因导入法分析高等植物转录调控DNA区域

基本信息

批准号：
62622003
负责人：
内藤哲
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1987
资助国家：
日本
起止时间：
1987 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

高等植物に於ける転写制御因子の研究は, 生化学的研究が精力的に進められている反面, 遺伝学的解析はその手法すら確立していないのが現状である. 本研究は植物における遺伝学的解析の系として有用なシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を用いて, 転写制御因子の変異株を解析する系の開発をめざすものである.解析のモデル系として大豆種子の7S貯蔵蛋白質(β-コングリシニン)遺伝子を選んだ. β-コングリシニンのα′-サブユニット遺伝子を転車開始点との最初のATGコンドとの間で切断し, 約1Kbから成る転写調制領域のDNAを単離した. これを大腸菌のβ-グルクロニダーゼの構造遺伝子部分と融合させ, キメラ遺伝子を作制した. このキメラ遺伝子をTiプラスミドを用いてシロイヌナズナに導入した. 得られた再生植物体では. 大豆のβ-コングリシニンプロモーターの制御下にβ-グルクロニダーゼを発現すると期待される. 従って, このトランスジェニックシロイヌナズナを用いてβ-グルクロニダーゼ活性を指標としたスクリーニングを行うことにより, β-コングリシニンプロモーターの転写活性の変化した変異株が分離できる.β-グルクロニダーゼは, 高等植物の系で実用化されているレポーター遺伝子としては最も使いやすいもののひとつであるが, 変異株のスクリーニングのためには栄養要求性マーカーの方がより有利である. シロイヌナズナではチアミン要求性変異株が知られている. チアミン要求性変異株のひとつについて調べた結果, チアミンりん酸ピロホスホリラーゼ活性が欠損していることが明らかになった. 大腸菌では, この酵素はthiB遺伝子にコードさている. 大腸菌のthiA B遺伝子を, このチアミン要求性シロイヌナズナ変異株に導入した結果, チアミン要求性が相補された.

尽管生化研究一直在进行上级植物的转录调节剂，但目前尚未确定遗传分析。这项研究旨在开发一种系统，用于使用拟南芥进行分析转录调节剂的突变菌株，该系统可作为植物中的遗传分析系统。选择大豆种子的基因作为分析模型系统。 β-加仑甘氨酸蛋白的α-subunit基因在β-加仑甘氨酸的α'-亚基基因之间被裂解，而第一个带有媒介物起始点的ATG Condone和转录调控区域中的DNA分离了约1 Kb。这与大肠杆菌中β-葡萄糖醛酸酶的结构基因部分融合在一起，形成了嵌合基因。使用Ti质粒将该嵌合基因引入拟南芥中。在所得的再生植物中，预计β-葡萄糖醛酸苷酶将在大豆中β-加仑蛋白启动子的控制下表达。因此，通过使用这种转基因拟南芥使用β-葡萄糖醛酸苷酶活性筛选，可以分离具有β-加仑素启动子转录活性改变的突变体。 β-葡萄糖醛酸酶是较高植物系统中最简单的报告基因之一，但富营养标记对于筛选突变体更为有利。在拟南芥中，已知硫胺素需要突变体。已经研究了硫胺素需要的突变体之一，并且发现缺乏硫胺素 - 磷酸二磷酸化酶活性。在大肠杆菌中，该酶在胫骨基因中编码。将大肠杆菌的Thia B基因引入了这种需要硫胺素的拟南芥突变体中，该突变体补充了硫胺素重新征的硫胺素。