開始のオン・オフにより周期的に複製を行う大腸菌ミニ染色体複製サイクルの再構成

通过打开和关闭启动来重建大肠杆菌微型染色体复制周期

• 批准号: 18048033
• 负责人: 末次 正幸
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18048033/
• 关键词: 大腸菌; DNA 複製; DNA複製

染色体複製の開始は細胞周期進行と連動して周期的に制御されている。大腸菌では、染色体複製起点を持つプラスミドDNAを鋳型とし、精製蛋白質を用いて染色体複製を再構成できる(ミニ染色体複製系)。複製開始反応は開始蛋白質DnaAのATP結合型(活性型)とADP結合型(不活性型)の変換によって制御されている。ATP-DnaAはRIDAという複製伸長反応と共役したDnaA結合性ATP加水分解機構によってADP-DnaAに変換される(不活性化システム)。またin vitroにおいては、特異的なDNA配列DARSによって、DnaA結合性ADPが解離し、ATP再結合が促されることが見いだされている(再活性化システム)。本研究では、開始のオン・オフによりコントロールされた複製サイクル系の再構成を目指すべく、不活性化システムの試験管内再構成系を確立した。この再構成系にはクランプと呼ばれるDNAポリメラーゼIII複合体のサブユニットとHdaタンパク質が必要である。不活性化システム再構成系を用いた解析から、ヌクレオチド結合によって促されるHdaの多量体構造の変換が、不活性化システムの発動に必要であることを見いだした。このHdaヌクレオチド結合は細胞内においてもDnaA活性制御に重要であった。さらに我々は、DARSが細胞内において再活性化に重要な機能を果たしていることを示し、DARS活性を調節する新規活性を見いだした。これらの結果は複製開始のオン・オフを制御する分子メカニズムを示唆するものであり、その周期性を再構成する上で重要な知見を提供するものである。

染色体复制的起始与细胞周期进程一起被定期调节。在大肠杆菌中，可以使用含有染色体复制起点的质粒DNA作为模板，使用纯化的蛋白质来重建染色体复制（微型染色体复制系统）。复制起始反应由起始蛋白 DnaA 在其 ATP 结合形式（活性形式）和 ADP 结合形式（非活性形式）之间的转换控制。 ATP-DnaA 通过 RIDA 转化为 ADP-DnaA，RIDA 是一种与复制延伸反应（失活系统）耦合的 DnaA 结合 ATP 水解机制。此外，在体外，已发现特定的DNA序列DARS解离结合DnaA的ADP并促进ATP重新结合（重新激活系统）。在本研究中，我们建立了灭活系统的体外重建系统，旨在重建由开/关启动控制的复制周期系统。该重建系统需要 DNA 聚合酶 III 复合物的一个亚基，称为钳和 Hda 蛋白。通过使用失活系统重建系统的分析，我们发现核苷酸结合促进的Hda多聚结构的转换对于失活系统的激活是必要的。这种 Hda 核苷酸结合对于调节细胞内的 DnaA 活性也很重要。此外，我们证明 DARS 在细胞内重新激活中发挥重要作用，并发现了调节 DARS 活性的新活性。这些结果表明了一种控制复制起始的开/关状态的分子机制，并为重建其周期性提供了重要的知识。

项目成果

The exceptionally tight affinity of DnaA for ATP/ADP requires a unique aspartic acid residue in the AAA+ sensor 1 motif

• DOI: 10.1111/j.1365-2958.2006.05450.x
• 发表时间: 2006-12-01
• 期刊: MOLECULAR MICROBIOLOGY
• 影响因子: 3.6
• 作者: Kawakami, Hironori;Ozaki, Shogo;Katayama, Tsutomu
• 通讯作者: Katayama, Tsutomu

大腸菌染色体の複製開始制御機構の発動メカニズム

大肠杆菌染色体复制起始控制机制的激活机制

• 发表时间: 2008
• 作者: 末次正幸;藤光和之;片山 勉
• 通讯作者: 片山 勉

Involvement of the Escherichia coli folate-binding protein YgfZ in RNA modification and regulation of chromosomal replication initiation

• DOI: 10.1111/j.1365-2958.2005.04932.x
• 发表时间: 2006-01-01
• 期刊: MOLECULAR MICROBIOLOGY
• 影响因子: 3.6
• 作者: Ote, T;Hashimoto, M;Kato, J
• 通讯作者: Kato, J

細胞周期進行と共役した大腸菌複製開始蛋白質DnaAの活性制御機構

大肠杆菌复制起始蛋白 DnaA 与细胞周期进程耦合的调控机制

• 发表时间: 2007
• 作者: 末次正幸;藤光和之;片山 勉
• 通讯作者: 片山 勉

The interaction of DiaA and DnaA regulates the replication cycle in E. coli by directly promoting ATP-DnaA-specific initiation complexes

• DOI: 10.1101/gad.1561207
• 发表时间: 2007-08-15
• 期刊: GENES & DEVELOPMENT
• 影响因子: 10.5
• 作者: Keyamura, Kenji;Fujikawa, Norie;Katayama, Tsutomu
• 通讯作者: Katayama, Tsutomu