タンパク質の構造を基盤とした大腸菌ＤＮＡ複製再開始機構の解明

基于蛋白质结构阐明大肠杆菌DNA复制重启机制

• 批准号: 16J00266
• 负责人: 藤山 紗希
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J00266/
• 关键词: 複製再開始プライモソーム; タンパク質ーDNA複合体; PrIB; DnaT; タンパク質間相互作用

大腸菌におけるDNA複製再開始機構の一つであるPriA依存的複製再開始は、複数のタンパク質（PriA、PriB、DnaT）がDNA上で規律的に結合・解離する多段階の反応である。そのため、各段階で起こるタンパク質－DNA間、あるいはタンパク質－タンパク質間の相互作用を理解し、それらを繋ぎ合わせることで、複製再開始の全容を解明することが出来ると考えた。本申請ではその中の一つのタンパク質であり、複製装置であるDnaB-DnaC複合体の再導入に必要なDnaTの構造及び機能の解析を通して、DNA複製再開始機構のメカニズムを解明することを目的とした。本年度は、DnaTと複製再開始因子の一つであるPriBとの相互作用解析を行い、PriBにおいてDnaT結合部位に存在する幾つかのアミノ酸の相互作用における重要性を変異体解析およびNMR解析によって調べた。その結果から複製再開始における一本鎖DNAがPriBに結合し、複合体を形成した後、DnaTによってPriB-一本鎖DNAの複合体から一本鎖DNAが解離するモデルの構築を行った。その結果は、現在論文として投稿準備中である。また、DnaTのN末ドメインの機能であるオリゴマー形成を調べる為、幾つかの変異体を作成し、オリゴマー形成に重要な部位を同定した。この情報を利用し、未だ判明していないDnaTN末の立体構造決定に向けて、現在検討を行っている。これらの結果に関しては２件の国際学会を含め、6件の学会発表を行った。

PriA 依赖性复制重新启动是大肠杆菌中 DNA 复制重新启动机制之一，是一种多步骤反应，其中多种蛋白质（PriA、PriB 和 DnaT）以严格的方式在 DNA 上结合和解离。因此，我们认为，通过了解每个步骤中发生的蛋白质-DNA 和蛋白质-蛋白质相互作用并将它们连接在一起，我们将能够阐明复制重启的全貌。本申请的目的是通过分析 DnaT 的结构和功能来阐明 DNA 复制重新启动的机制，DnaT 是这些蛋白质之一，对于重新引入 DnaB-DnaC 复合物（复制机制）是必需的。 。今年，我们分析了复制重新启动因子之一的 DnaT 和 PriB 之间的相互作用，并使用突变分析和 NMR 分析研究了 PriB 中 DnaT 结合位点中存在的几种氨基酸在相互作用中的重要性。基于这些结果，我们构建了一个模型，其中单链DNA在复制重启期间与PriB结合，形成复合物，然后通过DnaT从PriB-单链DNA复合物解离。目前正在准备将结果作为论文提交。此外，为了研究寡聚化（DnaT N 末端结构域的功能），我们创建了几个突变体并鉴定了对寡聚化重要的位点。利用这些信息，我们目前正在进行研究以确定 DnaTN 终端的三维结构，但目前尚不清楚。这些成果在六次学术会议上发表，其中包括两次国际会议。

项目成果

Analysis of DnaT oligomeric structure in Escherichia coli replication restart primosome

大肠杆菌复制重启引发体中 DnaT 寡聚结构分析

• 发表时间: 2017
• 作者: 池田陽平;藤山紗希;阿部 義人;片山 勉;植田 正
• 通讯作者: 植田 正

NMR Analysis of an Interaction between PriB and DnaT on Bacterial Replication Restart Primosome

核磁共振分析 PriB 和 DnaT 对细菌复制重启Primosome 的相互作用

• 发表时间: 2016
• 作者: 藤山 紗希;阿部 義人;片山 勉;植田 正
• 通讯作者: 植田 正

大腸菌 DNA 複製再開始因子 DnaT の多量体構造解析

大肠杆菌DNA复制重新启动因子DnaT多聚体结构分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 池田 陽平;藤山紗希;阿部 義人;片山 勉;植田 正
• 通讯作者: 植田 正

大腸菌DNA複製再開始タンパク質PriB・DnaTの構造を基盤とした相互作用解析

大肠杆菌 DNA 复制重新启动蛋白 PriB 和 DnaT 的基于结构的相互作用分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 藤山 紗希;阿部 義人;片山 勉;植田 正
• 通讯作者: 植田 正

大腸菌 DNA 複製再開始因子 DnaT の構造と機能

大肠杆菌 DNA 复制重新启动因子 DnaT 的结构和功能

• 发表时间: 2016
• 作者: 阿部 義人;藤山 紗希;池田 陽平;片山 勉;植田 正
• 通讯作者: 植田 正