DNA複製マシンによる複製開始フィードバック制御の分子機構

DNA复制机复制起始反馈控制的分子机制

• 批准号: 02J09038
• 负责人: 末次 正幸
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J09038/
• 关键词: DNA複製; 細胞周期; DnaA蛋白質; AAA^+スーパーファミリー; スライディングクランプ; DNA複製; 細胞周期; DnaA蛋白質; AAA^+スーパーファミリー; スライディングクランプ

当研究室では、大腸菌染色体の複製開始蛋白質DnaAに結合したATPの水解により、DnaAの不活化を導く機構、RIDA(Regulatory Inactivation of DnaA)を見出している。RIDAに8は、DNAポリメラーゼIIIβサブユニットがDNAにロードされ、βクランプを形成することが必要である。よって、複製装置にはフィードバック的に、複製開始を抑制するという概念が提唱される。最近、RIDAに必須な新奇蛋白質Hdaが同定され、RIDA構成因子が出揃った。そこで本研究では、Hisタグ融合型としてHdaを精製し、RIDA反応を生化学的に解析した。まず、RIDA再構成系(DNAにロードされたβクランプをゲル濾過により単離し、これを用いてHdaに依存したDnaA結合性ATPの加水分解を行う)を構築し解析した結果、HdaはADP結合により活性型となることが示唆された。実際、フィルターバインディング法により、HdaはADPに高い特異性を持って結合することがわかった(Kd値、約2μM)。次に、βクランプ・Hda・DnaAの3者の相互作用について検討した。まず、プルダウン法により、βサブユニットはHdaと直接結合することがわかった。さらに、ゲル濾過による解析から、DNAにロードさせたβサブユニット(βクランプ)はHdaおよびATP結合型DnaAにそれぞれ単独で結合することが見出された。よって、βクランプを足場にしてHdaとATP-DnaAが相互作用する可能性が示唆される。このときHdaがDnaA結合性ATPに作用し、その加水分解を促しているのかもしれない。DnaAおよびHdaはともにAAA+型ATPase蛋白質であるが、一部のAAA+蛋白質については、複合体を形成し、分子間の境界でATP加水分解を行うことが提唱されている。RIDAの分子機構もこれと矛盾しないと思われる。

我们的实验室发现了RIDA（DNAA的调节失活），该机制通过与大肠杆菌染色体的复制起始蛋白DNAA结合的ATP水解导致DNAA失活。 RIDA要求将DNA聚合酶IIIβ亚基β加载到DNA中并形成β夹。因此，以反馈方式在复制设备中提出了抑制复制启动的概念。最近，已经确定了一种新型的蛋白质HDA，对于RIDA必不可少，并且已经编译了RIDA成分因素。因此，在这项研究中，HDA被纯化为HIS标签融合类型，并在生化中分析了RIDA反应。首先，我们构建并分析了RIDA重建系统（通过凝胶过滤分离到DNA中的β夹具，并用于水解HDA依赖性DNAA结合ATP），发现HDA由于ADP结合而成为一种活性形式。实际上，滤波器结合方法表明，HDA具有高特异性（KD值，约2μM）与ADP结合。接下来，我们研究了三方（Beta-Clamp，HDA和DNAA）之间的相互作用。首先，发现β亚基通过下拉方法直接与HDA结合。此外，通过凝胶过滤的分析表明，单独与HDA和ATP结合的DNAA结合的DNA负载的β亚基（β夹具）。这表明HDA和ATP-DNAA可以使用β夹具作为支架相互相互作用。目前，HDA可能对DNAA结合ATP作用，这可能鼓励其水解。 DNAA和HDA都是AAA+ ATPase蛋白，但是对于某些AAA+蛋白，已提出形成复合物并在分子间边界进行ATP水解。 RIDA的分子机制似乎与此不一致。