DNA複製マシンによる複製開始フィードバック制御の分子機構

DNA复制机复制起始反馈控制的分子机制

• 批准号: 02J09038
• 负责人: 末次 正幸
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J09038/
• 关键词: DNA複製; 細胞周期; DnaA蛋白質; AAA^+スーパーファミリー; スライディングクランプ

当研究室では、大腸菌染色体の複製開始蛋白質DnaAに結合したATPの水解により、DnaAの不活化を導く機構、RIDA(Regulatory Inactivation of DnaA)を見出している。RIDAに8は、DNAポリメラーゼIIIβサブユニットがDNAにロードされ、βクランプを形成することが必要である。よって、複製装置にはフィードバック的に、複製開始を抑制するという概念が提唱される。最近、RIDAに必須な新奇蛋白質Hdaが同定され、RIDA構成因子が出揃った。そこで本研究では、Hisタグ融合型としてHdaを精製し、RIDA反応を生化学的に解析した。まず、RIDA再構成系(DNAにロードされたβクランプをゲル濾過により単離し、これを用いてHdaに依存したDnaA結合性ATPの加水分解を行う)を構築し解析した結果、HdaはADP結合により活性型となることが示唆された。実際、フィルターバインディング法により、HdaはADPに高い特異性を持って結合することがわかった(Kd値、約2μM)。次に、βクランプ・Hda・DnaAの3者の相互作用について検討した。まず、プルダウン法により、βサブユニットはHdaと直接結合することがわかった。さらに、ゲル濾過による解析から、DNAにロードさせたβサブユニット(βクランプ)はHdaおよびATP結合型DnaAにそれぞれ単独で結合することが見出された。よって、βクランプを足場にしてHdaとATP-DnaAが相互作用する可能性が示唆される。このときHdaがDnaA結合性ATPに作用し、その加水分解を促しているのかもしれない。DnaAおよびHdaはともにAAA+型ATPase蛋白質であるが、一部のAAA+蛋白質については、複合体を形成し、分子間の境界でATP加水分解を行うことが提唱されている。RIDAの分子機構もこれと矛盾しないと思われる。

我们实验室发现了RIDA（DnaA调节失活），这是一种通过水解与大肠杆菌染色体复制起始蛋白DnaA结合的ATP而导致DnaA失活的机制。 DNA 聚合酶 III β 亚基加载到 DNA 上并形成 β 钳需要 RIDA 8。因此，针对复制设备提出了以反馈方式抑制复制开始的构思。最近，鉴定出RIDA必需的一种新蛋白Hda，并鉴定了RIDA的组成因子。因此，在本研究中，我们将 Hda 纯化为 His 标记的融合型，并对 RIDA 反应进行生化分析。首先，我们构建并分析了 RIDA 重建系统（通过凝胶过滤分离负载在 DNA 上的 β-clamp，并用于对 DnaA 结合的 ATP 进行 Hda 依赖性水解），并发现 Hda 是 ADP 结合的。它变成了一个活跃的类型。事实上，使用过滤结合法，发现Hda与ADP结合具有高特异性（Kd值，约2μM）。接下来，我们研究了 β-clamp、Hda 和 DnaA 之间的相互作用。首先，下拉分析显示β亚基直接与Hda结合。此外，凝胶过滤分析表明，加载到 DNA 上的 β 亚基（β 夹）分别与 Hda 和 ATP 结合的 DnaA 结合。因此，表明 Hda 和 ATP-DnaA 可能使用 β-clamp 作为支架相互作用。此时，Hda可能作用于结合DnaA的ATP，促进其水解。 DnaA和Hda都是AAA+型ATP酶蛋白，并且已经提出一些AAA+蛋白形成复合物并在分子之间的边界处进行ATP水解。 RIDA的分子机制似乎与此一致。

项目成果

Takayuki Obita, Takafumi Iwata, Masayuki Suetsugu, Yoichiro Yoshida, Yoshitsugu Tanaka, Tsutomu Katayama, Tadashi Ueda, Taiji Imoto: "Determination of the secondary structure in solution of the scherichia coli DnaA DNA-binding domain"Biochemical and Bioph

Takayuki Obita、Takafumi Iwata、Masayuki Suetsugu、Yoichiro Yoshida、Yoshitsugu Tanaka、Tsutomu Katayama、Tadashi Ueda、Taiji Imoto：“大肠杆菌 DnaA DNA 结合结构域溶液中二级结构的测定”生化和 Bioph

Masayuki Suetsugu, Hironori Kawakami, Kenji Kurokawa, Toshio Kubota, Makoto Takata, Tsutomu Katayama: "DNA replication-coupled inactivation of DnaA protein in vitro a role for DnaA arginine-334 of the AAA+ Box VIII motif in ATP hydrolysis"Molecular Microb

Masayuki Suetsugu、Hironori Kawakami、Kenji Kurokawa、Toshio Kubota、Makoto Takata、Tsutomu Katayama：“体外 DnaA 蛋白的 DNA 复制耦合失活对 AAA Box VIII 基序的 DnaA 精氨酸-334 在 ATP 水解中的作用”分子微生物