巨大モーター蛋白質ダイニンのX線結晶構造に基づいた機能解析

基于巨运动蛋白动力蛋白X射线晶体结构的功能分析

基本信息

批准号：
17053006
负责人：
栗栖源嗣
金额：
$ 2.5万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ダイニンはATP依存的に微小管上を滑り運動するモーター蛋白質で、重鎖・中間鎖・軽鎖から構成される1000kDaを超える生体超分子複合体である。鞭毛運動や繊毛運動、さらに蛋白質輸送や染色体分離運動を担うモーター蛋白質であり、その生物学的重要性は極めて高い。我々は、モーター活性を保持し構造解析用に精製可能な組換え体タンパク質、細胞質ダイニンモータードメイン(DynMD:3343残基)を用いてX線による構造-機能相関の研究をスタートさせた。動的光散乱法(DLS)でDynMDの分子サイズ均一性を確認し、併せて安定に存在する溶液状態の検索を行った。DLS解析により、均一な分子サイズをもち、かつ安定に存在する溶液条件を見つけることができた。この基本溶液条件をベースにタグ付き、タグ無しの二種類のDynMDを用いて、Native状態、ADP+Vi状態、ADP結合状態と網羅的に結晶化条件の検索を行っているが、現在までのところ単結晶は得られていない。引き続き、AMPPNPやAMPPCPなどのATPアナログ結合状態での結晶化にもトライする予定である。細胞質ダイニンの微小管と結合する領域は、長いcoiled-coil領域によってATPの加水分解を行う球状ドメインと繋がれている。この微小管と結合するドメインはストークドメインと呼ばれている。東京大学大学院総合文化研究科・豊島陽子助教授と共同で細胞質ダイニンストークドメインの組換え体結晶構造解析を並行してスタートさせた。PEG3350を沈殿剤とした時に再現性良く棒状の結晶を得ることに成功している。KEK-PFのAR-NW12ビームラインにおいて、Se置換体結晶を使った3.1〜3.25Å分解能のSe-MAD測定を行った。結晶が非常に柔らく不安定で、回折強度が非常に弱いという特徴をもつが、構造解析向けて鋭意解析計算を行っている最中である。

动力蛋白是一种以 ATP 依赖性方式在微管上滑动的运动蛋白，是由重链、中间链和轻链组成的超过 1000 kDa 的生物超分子复合物。它是一种运动蛋白，负责鞭毛运动、纤毛运动、蛋白质运输和染色体分离运动，其生物学重要性极高。我们开始使用细胞质动力蛋白运动结构域（DynMD：3343 个残基）进行结构与功能关系的 X 射线研究，这是一种保留运动活性并可纯化用于结构分析的重组蛋白。我们使用动态光散射 (DLS) 确认了 DynMD 的分子尺寸均匀性，并寻找稳定的溶液状态。通过DLS分析，我们能够找到分子大小均匀且稳定存在的溶液条件。基于这些基本溶解条件，我们使用标记和未标记两种类型的DynMD来综合搜索包括Native状态、ADP+Vi状态和ADP结合状态的结晶条件，但尚未获得单晶。随后，我们计划尝试 ATP 类似物结合态的结晶，例如 AMPPNP 和 AMPPPP。细胞质动力蛋白的微管结合区域通过长卷曲螺旋区域连接至水解 ATP 的球状结构域。与微管结合的结构域称为茎结构域。我们与东京大学艺术与科学研究生院副教授 Yoko Toyoshima 合作，开始对重组细胞质动力蛋白茎结构域进行平行晶体结构分析。当使用PEG3350作为沉淀剂时，我们成功地获得了具有良好重现性的棒状晶体。在 KEK-PF 的 AR-NW12 光束线上，我们使用 Se 取代晶体进行了分辨率为 3.1 至 3.25 Å 的 Se-MAD 测量。该晶体非常柔软且不稳定，衍射强度非常弱，但我们目前正在进行密集的分析计算来分析其结构。