核内のヒストンアセチル化を時空間的に観察可能にする蛍光プローブの開発

开发能够时空观察细胞核内组蛋白乙酰化的荧光探针

基本信息

批准号：
17050028
负责人：
伊藤昭博
金额：
$ 3.78万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

蛋白質アセチル化は、ヒストンアセチル化酵素によって正に、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)によって負に、ダイナミックに制御されている。真核生物の染色体DNAは、クロマチンと呼ばれるDNAとヒストンからなる高次構造をとっている。そのクロマチン構造の変化が遺伝子発現のオン・オフを決める役割を果たしていると考えられており、ヒストンのアセチル化はクロマチン構造変化を制御する主要な翻訳後修飾である。そこで、細胞内におけるヒストンのアセチル化及び脱アセチル化を、生きたままの細胞で観察することができ、かつ時間・空間分解能をもった解析を可能にする蛍光プローブを開発した。この蛍光プローブは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を起こす二つの蛍光蛋白質の間に、アセチル化される基質ドメインとアセチル化リジン結合ドメインがリンカー配列によって連結している。この蛍光プローブ内の基質ドメインがアセチル化されると、アセチル化リジン結合ドメインとアセチル化された基質ドメインとの結合により、蛍光プローブの構造が変化する。この構造変化により起こる二つの蛍光蛋白質間のFRETの変化を蛍光強度比変化として検出する。作製した蛍光プローブが生細胞内で内在性のヒストンH4と同様の挙動をし、蛍光プローブのアセチル化をFRET変化に伴う蛍光強度比変化として検出可能であることを示した。本年度、作製した蛍光プローブを用いて各種HDAC阻害剤による生細胞内でのピストンH4アセチル化誘導の違いを調べた。また、この蛍光プローブを用いて、有糸分裂過程におけるヒストンH4のアセチル化状態を観察した。染色体が凝集するとともにヒストンH4の脱アセチル化が起こり、分裂終期の後半には分裂前のアセチル化状態まで回復することがわかった。

蛋白质乙酰化由组蛋白乙酰基酶对组蛋白乙酰酶进行了积极调节，由组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）否定性地调节。真核染色体DNA是由称为染色质和组蛋白的DNA组成的高阶结构。人们认为，染色质结构的变化在确定基因表达的开/关中起作用，组蛋白乙酰化是调节染色质结构变化的主要翻译后修饰。因此，我们开发了一种荧光探针，可以在活细胞中观察到细胞中组蛋白的乙酰化和脱乙酰化，并允许通过时间和空间分辨率进行分析。该荧光探针通过两个经历荧光共振能传递（FRET）的荧光蛋白之间的接头序列（FRET）将底物结构域和乙酰化赖氨酸结合结构域连接起来。当该荧光探针内的底物结构域被乙酰化时，乙酰化赖氨酸结合结构域与乙酰化底物结构域的结合改变了荧光探针的结构。由于这种结构变化引起的两种荧光蛋白之间的FRET变化被检测为荧光强度比的变化。制备的荧光探针的行为与活细胞中的内源性组蛋白H4相似，表明可以检测到荧光探针的乙酰化是随着荧光强度比的变化而变化的。今年，我们使用今年制备的各种HDAC抑制剂研究了活塞H4乙酰化在活细胞中活塞H4乙酰化诱导的差异。此外，使用这种荧光探针，观察到有丝分裂过程中组蛋白H4的乙酰化态。发现在有丝分裂阶段末期的下半段中，发生了组蛋白H4的染色体聚集体和组蛋白H4的脱乙酰化。