核内のヒストンアセチル化を時空間的に観察可能にする蛍光プローブの開発

开发能够时空观察细胞核内组蛋白乙酰化的荧光探针

基本信息

批准号：
17050028
负责人：
伊藤昭博
金额：
$ 3.78万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

蛋白質アセチル化は、ヒストンアセチル化酵素によって正に、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)によって負に、ダイナミックに制御されている。真核生物の染色体DNAは、クロマチンと呼ばれるDNAとヒストンからなる高次構造をとっている。そのクロマチン構造の変化が遺伝子発現のオン・オフを決める役割を果たしていると考えられており、ヒストンのアセチル化はクロマチン構造変化を制御する主要な翻訳後修飾である。そこで、細胞内におけるヒストンのアセチル化及び脱アセチル化を、生きたままの細胞で観察することができ、かつ時間・空間分解能をもった解析を可能にする蛍光プローブを開発した。この蛍光プローブは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を起こす二つの蛍光蛋白質の間に、アセチル化される基質ドメインとアセチル化リジン結合ドメインがリンカー配列によって連結している。この蛍光プローブ内の基質ドメインがアセチル化されると、アセチル化リジン結合ドメインとアセチル化された基質ドメインとの結合により、蛍光プローブの構造が変化する。この構造変化により起こる二つの蛍光蛋白質間のFRETの変化を蛍光強度比変化として検出する。作製した蛍光プローブが生細胞内で内在性のヒストンH4と同様の挙動をし、蛍光プローブのアセチル化をFRET変化に伴う蛍光強度比変化として検出可能であることを示した。本年度、作製した蛍光プローブを用いて各種HDAC阻害剤による生細胞内でのピストンH4アセチル化誘導の違いを調べた。また、この蛍光プローブを用いて、有糸分裂過程におけるヒストンH4のアセチル化状態を観察した。染色体が凝集するとともにヒストンH4の脱アセチル化が起こり、分裂終期の後半には分裂前のアセチル化状態まで回復することがわかった。

蛋白质乙酰化受组蛋白乙酰化酶的正向动态调节和组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 的负向调节。真核生物的染色体DNA具有称为染色质的高级结构，由DNA和组蛋白组成。染色质结构的变化被认为在决定基因表达是否开启或关闭方面发挥着作用，而组蛋白乙酰化是控制染色质结构变化的主要翻译后修饰。因此，我们开发了一种荧光探针，可以观察活细胞中的细胞内组蛋白乙酰化和脱乙酰化，并能够进行时间和空间分辨率的分析。在该荧光探针中，待乙酰化的底物结构域和乙酰化的赖氨酸结合结构域通过进行荧光共振能量转移（FRET）的两个荧光蛋白之间的接头序列连接。当该荧光探针内的底物结构域被乙酰化时，由于乙酰化赖氨酸结合结构域和乙酰化底物结构域之间的结合，荧光探针的结构发生变化。由这种结构变化引起的两种荧光蛋白之间的 FRET 变化被检测为荧光强度比的变化。我们表明，所制备的荧光探针的行为与活细胞中的内源性组蛋白 H4 相似，并且荧光探针的乙酰化可以通过 FRET 变化引起的荧光强度比的变化来检测。今年，我们使用制备的荧光探针研究了各种 HDAC 抑制剂对活细胞中活塞 H4 乙酰化诱导的差异。使用该荧光探针，我们还观察了有丝分裂过程中组蛋白 H4 的乙酰化状态。研究发现组蛋白H4随着染色体聚集而发生脱乙酰化，并且在末期后半期乙酰化状态恢复到有丝分裂前状态。