転写関連因子のアセチル化を可視化するシステムの開発

开发转录相关因子乙酰化可视化系统

基本信息

批准号：
17054046
负责人：
伊藤昭博
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17054046/
关键词：
FRET アセチル化ヒストン p53 蛍光プローブ

项目摘要

翻訳後修飾としてのアセチル化はヒストンの構造機能を制御することにより遺伝子の発現を制御するだけでなく、がん抑制遺伝子産物であるp53を初めとした様々な転写因子の活性化を制御することによっても転写を制御していることが明らかになってきた。そこで、ヒストンとp53のアセチル化を生細胞内で可視化する蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を原理とした蛍光プローブの開発を行った。上記蛍光プローブはDECODE回路を追究するための強力な手段になりうると考えられる。アセチル化ヒストンを検出する蛍光プローブを作製するために、FRETを起こす蛍光ドナー蛋白質であるCFPにヒストンH4を連結した蛋白質と蛍光アクセプター蛋白質であるYFPにアセチル化ヒストンH4結合蛋白質を連結した蛋白質をリンカーで結ぶことによって、アセチル化依存的に分子内でFRET変化を起こすヒストンH4アセチル化の蛍光プローブを作製し、内在性のヒストンH4と同様にクロマチン内に取り込まれていることを確認した。さらに、ヒストン脱アセチル化阻害剤であるトリコスタチンA(TSA)によって蛍光プローブのアセチル化が誘導され、FRET変化が起きることを確認した。以上の結果から、作製した蛍光プローブは生細胞内で内在性のヒストンH4と同様の挙動を示し、蛍光プローブのアセチル化はFRET変化に伴う蛍光強度比変化として検出可能であることが分かった。アセチル化p53を検出する蛍光プローブを作製するために、同様にCFPにp53を連結した蛋白質とYFPにアセチル化p53結合蛋白質を連結した蛋白質をリンカーで結ぶことによって、アセチル化依存的に分子内でFRET変化を起こすp53アセチル化の蛍光プローブを作製した。作製した蛍光プローブが核に取り込まれていることを確認した。

乙酰化是一种翻译后修饰，不仅通过控制组蛋白的结构和功能来控制基因表达，而且还控制多种转录因子的激活，包括抑癌基因产物p53。目前已经清楚，转录也受组蛋白的控制。因此，我们开发了一种基于荧光共振能量转移 (FRET) 的荧光探针，用于可视化活细胞中的组蛋白和 p53 乙酰化。人们认为上述荧光探针可以成为研究解码电路的有力工具。为了创建检测乙酰化组蛋白的荧光探针，我们将一种将组蛋白 H4 连接到 CFP（一种引起 FRET 的荧光供体蛋白）的蛋白质，并将乙酰化组蛋白 H4 结合蛋白连接到 YFP（一种荧光受体蛋白）。通过将结合蛋白与连接子连接，我们创建了组蛋白 H4 乙酰化的荧光探针，该探针以乙酰化依赖性方式引起分子内 FRET 变化，并证实它以与内源性组蛋白 H4 相同的方式掺入染色质。此外，我们证实组蛋白脱乙酰化抑制剂曲古抑菌素 A (TSA) 会诱导荧光探针乙酰化并引起 FRET 变化。上述结果表明，所制备的荧光探针与活细胞中的内源性组蛋白H4表现相似，并且荧光探针的乙酰化可以通过由于FRET的变化而引起的荧光强度比的变化来检测。为了制作检测乙酰化p53的荧光探针，通过将p53与CFP连接的蛋白质和乙酰化p53结合蛋白质与YFP连接的蛋白质用接头连接，检测乙酰化的分子内活性。我们创建了一种用于 p53 乙酰化的荧光探针，可引起 FRET 变化。我们确认制备的荧光探针已掺入细胞核中。